热休克小鼠肝癌细胞(H_(22))源Exosomes的体内抗肝癌作用研究

目的:在荷瘤 BALB/c 小鼠观察热休克小鼠肝癌细胞(H_(22))源 Exosomes(HS-Exo) 激发宿主抗肝癌免疫应答的效应.方法:用自行分离纯化的小鼠肝癌细胞 H_(22) 源 Exosomes 及 HS-Exo 免疫小鼠,然后给小鼠皮下接种 H_(22) 肿瘤细胞,观察肿瘤的生长状况.用MTT法检测小鼠脾细胞增殖情况和细胞毒活性;用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞浸润情况.BALB/c 小鼠皮下接种 H_(22) 细胞,肿瘤长至可触及大小后,分别注射Exosomes及HS-Exo进行治疗,观察各组肿瘤大小及其小鼠存活期.结果:与对照组 Exosomes 相比,HS-Exo 能使肿瘤出现时间延迟,肿瘤生长缓慢(P<0.05);更能促进脾淋巴细胞增殖并增强其细胞毒活性(P<0.05),能更有效的诱导 CD_4~+ 和 CD_8~+T 细胞活化(P<0.05);更为显著的抑制了小鼠的肿瘤生长(P<0.05).结论:HS-Exo 具有更强的免疫活性,能更好的诱导小鼠抗 H_(22) 肝癌作用,有针对亲本细胞的免疫保护作用,并且具有更为显著的肿瘤治疗作用.     

热应激小鼠肝癌细胞(H22)源Exosomes的抗肿瘤免疫机制

 目的 制备小鼠肝癌细胞（H₂₂）源Exosomes及热应激小鼠肝癌细胞（H₂₂）源HS-Exo （heat stressed Exosomes,HS-Exo）,研究其对小鼠可能的抗肿瘤免疫机制。方法 用超速分级离心和蔗糖密度梯度离心纯化获得Exosomes及HS-Exo,透射电镜观察其形态。以Exosomes为对照,观察HS-Exo的蛋白组分、产量及其激发宿主抗肝癌免疫应答效应,用Western blot方法检测两者所含有的相关蛋白情况。用MTT法检测免疫小鼠脾细胞增殖和脾淋巴细胞的细胞毒活性。用免疫组化法检测经两者免疫后小鼠肿瘤组织中CD4+、CD8+淋巴细胞浸润情况。结果 HS-Exo与Exosomes形态相似,HS-Exo所含的重要免疫蛋白表达增加（P<0.05）,用HS-Exo免疫小鼠后比用Exosomes免疫小鼠能更有效地抑制肿瘤生长,更好地诱导淋巴细胞增殖,更显著增强小鼠脾淋巴细胞的细胞毒活性以及更明显的肿瘤治疗作用（P<0.05）。结论 热应激制备HS-Exo的方法具有可行性,HS-Exo比Exosomes具有更强的免疫活性和肿瘤治疗作用。     

肿瘤源性外切体负载的间充质干细胞抗肿瘤活性的实验研究

目的:分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体及同基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);将外切体负载经γ干扰素(IFN-γ)刺激活化的间允质干细胞,探讨其抗肝癌细胞活性改变.方法:利用超滤及密度梯度离心法分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体;利用贴壁培养联合免疫磁珠阴性分选法体外培养同基因小鼠骨髓间充质干细胞;外切体负载活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育,72 h后观察H22细胞增殖状态.结果:外切体负载的IFN-γ刺激活化的间允质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育72 h后,活化组H22细胞增殖速度明显低于对照组.结论:负载肿瘤源性外切体的间充质干细胞抗肝癌细胞活性明显增强,间充质干细胞联合肿瘤源性外切体有可能成为一种更为有效的外切体疫苗诱导抗肿瘤效应.     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

甘露聚糖修饰的重组小鼠甲胎蛋白的抗肿瘤免疫作用研究

目的研究用甘露聚糖修饰后的甲胎蛋白（AFP）对肿瘤免疫的促进作用。方法用小鼠建立原发性肝癌模型，以AFP作为模型抗原，将重组小鼠AFP（mAFP）与氧化型的甘露聚糖相连接制成疫苗（Ox-M-mAFP），同时用未与甘露聚糖连接的mAFP作为对照，研究该疫苗在小鼠体内的肿瘤免疫治疗效果。结果Ox-M-mAFP可在小鼠体内诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，免疫后小鼠脾内得到的CD8^＋T淋巴细胞显示出对特异性分泌AFP的肿瘤细胞的杀伤活性。结论本实验提供了一种有效激活机体针对自身分子免疫应答的肿瘤疫苗策略，也对原发性肝癌的非手术治疗提供了一个可能的研究方向。     

H22源exosomes瘤苗在小鼠体内的抗肿瘤及免疫调节作用

目的:探讨exosomes瘤苗对小鼠免疫功能及肝癌移植瘤生长的影响.方法:从培养的小鼠肝癌H22细胞上清中分离exosomes瘤苗,以H22细胞接种BALB/e小鼠建市动物模型,随机分为exosomes瘤苗接种组及PBS对照组.15 d后处死小鼠,测量移植瘤体重量,计算抑瘤率;分别称取脾重、胸腺重,检测荷瘤小鼠脾脏指数和胸腺指数;用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞毒活性;酶连免疫吸附试验(Enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测脾淋巴细胞产生IL-2、INF-γ的能力.结果:接种exosomes瘤苗能显著抑制肿瘤生长,抑瘤率达42.26%;与对照组比较,实验组荷瘤鼠胸腺指数、脾指数显著提高(P<0.05);exosomes促进脾淋巴细胞增殖并增强其细胞毒活性,同时脾淋巴细胞培养上清中IL-2、INF-γ的水平升高.结论:exosomes瘤苗可能通过增强小鼠的免疫功能抑制小鼠肝癌移植瘤生长.     

玉屏风散对Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠免疫调节的影响

目的：探讨玉屏风散对肝癌荷瘤小鼠机体免疫的调节作用。方法：采用皮下接种Hepa1-6肿瘤细胞建立肝癌荷瘤C57BL／6小鼠模型;应用流式细胞技术检测和分析荧光标记的免疫细胞亚群。结果：玉屏风散20、25、30g生药·kg“对Hepa1-6肝癌荷瘤C57小鼠的抑瘤率分别为18．86％、28．81％、37．44％。与模型对照组比较,玉屏风散组胸腺重量和胸腺指数无变化,脾重和脾脏指数均呈上升趋势,脾脏中CD19^＋B细胞数量、CD19^＋CD80^＋B细胞比例、巨噬细胞比例和数量、CD4^＋T和CD8^＋T细胞数量以及肿瘤组织中CD4^＋T和CD8^＋T细胞比例均显著增加（P〈0．05,P〈0．01）,而脾脏中CD19^＋B细胞、CD4^＋T和CD8^＋T细胞的比例均无变化（P〉0．05）。结论：玉屏风散对肝癌荷瘤小鼠机体免疫具有广泛调节和增强作用,为玉屏风散在临床抗肝癌中的合理应用提供了实验依据。     

供者淋巴细胞输注对H22肝癌荷瘤小鼠免疫功能及瘤体生长的影响

目的 探讨供者淋巴细胞输注（donor lymphocyte infusion，DLI）及其联合化疗（氟尿嘧啶，5-Fu）对H22肝癌荷瘤小鼠免疫功能及瘤体生长的影响。方法 荷瘤昆明（KM）小鼠随机分4组：荷瘤对照组（A组）、5-Fu组（B组）、DLI组（C组）、联合组（D组）。检测各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群和IL-2水平的变化及NK细胞的活性，计算瘤体生长抑制率。结果 C、D两组小鼠外周血CD3^＋、CD4^＋、CD4^＋／CD8^＋、IL-2水平及NK细胞活性明显高于A、B两组（P〈0.05）。B、C、D各组抑瘤率分别为61．3％、34，7％、89．5％。结论 供者淋巴细胞输注与化疗联合使用可以抑制实体瘤的生长，提高H22肝癌荷瘤小鼠的免疫功能，诱导有效的移植物抗肿瘤效应，是一种潜在可行的实体瘤细胞过继免疫治疗方法。     

肿瘤坏死因子基因转导的肿瘤疫苗对小鼠机体免疫的影响

目的：用肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞作为肿瘤疫苗，研究其对小鼠机体免疫活性的影响。方法：小鼠分5组，采用经^60Co照射的含人肿瘤坏死因子基因的人肝癌细胞(BEL—7404—TNF—^60Co)、未经^60Co照射的含人肿瘤坏死因子基因的人肝癫细胞(BEL—7404—TNF)、经^60Co照射的人肝癌细胞(BEL—7404—^60Co)、未经^60Co照射的人肝癌细胞(BEL—7404)和生理盐水分别接种小鼠，用MTT法检测各组小鼠脾脏NK细胞活性，用SABC免疫组化法检测T淋巴细胞亚群。结果：肿瘤疫苗接种小鼠后，BEL—7404—TNF—^60Co组小鼠脾脏NK细胞活性及T淋巴细胞亚群CD4^ 、CD8^ 增高，与BEL—7404组、BEL—7404—^60Co组、生理盐水组相比差异有显著意义(P＜0．05、P＜0．01)。BEL—7404—TNF—^60Co组和BEL—7404—TNF组相比，NK细胞活性、T淋巴细胞亚群CD4^ 、CD8^ 均无显著差异(P＞0．05)。结论：肿瘤坏死因子基因转导的肿瘤疫苗具有提高小鼠机体免疫力的作用。     

小鼠CD4~+T细胞外泌体分离及鉴定

目的探讨CD4~+T细胞是否具有分泌外泌体的能力,以及CD4~+T细胞外泌体参与炎症及肿瘤免疫过程的可能。方法应用断颈处死的方法取出小鼠的脾脏,用磁珠分选的方法从小鼠脾脏细胞中分选出CD4~+T细胞,并尝试从培养基上清液中提取CD4~+T细胞的外泌体,在透射电镜下观察,后用PCR技术分析miR-23a、miR-214的表达情况。结果在透射电镜下能够观察到提取出的CD4~+T细胞外泌体,且用PCR技术能检测到小鼠CD4~+T细胞外泌体中miR-23a、miR-214这两个炎症及肿瘤相关的miRNA的表达。结论小鼠CD4~+T细胞有分泌外泌体的能力,且为CD4~+T细胞外泌体参与炎症及肿瘤相关过程提供了可能。     

不同品系H22肝癌小鼠证候特征的比较研究

目的:观察并比较常用不同品系H22肝癌小鼠中医证候的特征与差异。方法:将KM、BALB/c、ICR、C57共4种品系小鼠各30只,分别随机分成正常对照组10只,肝癌组20只。肝癌组小鼠右腋下接种H22细胞造成荷瘤小鼠模型,观察出瘤后各品系肝癌小鼠生存率差异,采用小鼠四诊工作站及其方法,检测小鼠证候的发生与演变。结果:4种品系小鼠腋下接种后均形成实体瘤。在生存率方面,早期各品系肝癌小鼠无明显差异;中晚期差异大,BALB/c肝癌小鼠最低,ICR与KM肝癌小鼠其次,C57肝癌小鼠最高。瘤体积比较,KM肝癌小鼠增长最快,ICR肝癌小鼠增长最慢。去瘤体质量方面,中晚期各荷瘤小鼠呈现下降趋势,ICR小鼠下降最明显,其次是BALB/c与KM小鼠,C57小鼠去瘤体质量变化小。另外,不同品系肝癌小鼠邪毒证与气虚证贯穿疾病始终,且程度逐渐加重,阴虚证与阳虚证在中晚期发生且逐渐加重,其中BALB/c与ICR肝癌小鼠气虚、阴虚、阳虚最严重。结论:KM、BALB/c、ICR、C57等不同品系H22肝癌小鼠均会自发形成证候,KM小鼠最适合于肝癌证候与辨证论治的研究。     

食管鳞癌患者来源移植瘤模型：B-NDG®小鼠与BALB/c裸鼠的比较

目的 探讨不同品系的小鼠对于食管鳞癌患者来源的异种移植瘤（ESCC PDX）成瘤率的影响,为ESCC的临床个体化治疗建立更优势的临床前动物模型。方法 收集22例ESCC患者手术切除的肿瘤组织,分别利用B-NDG®（NSG）鼠和BALB/c裸鼠来建立ESCC PDX模型。通过观察移植瘤成瘤情况,测量移植瘤体积,绘制生长曲线图,计算成瘤率和成瘤时间,HE染色、免疫组化及基因组测序等实验,比较移植瘤组织与原患者肿瘤组织的一致性。结果 22例标本的PDX模型移植结束,发现NSG小鼠ESCC肿瘤发生率（50%,11/22）高于BALB/c裸鼠（18.18%,4/22）（P=0.027）。NSG小鼠的平均肿瘤成瘤时间为75.95 d短于BALB/c小鼠的91.67 d,差异具有统计学意义（P<0.001）。在NSG小鼠和BALB/c小鼠异种移植模型中,肿瘤均能保持病人ESCC肿瘤组织的形态学特征。基因分析结果显示,与BALB/c裸鼠相比,NSG小鼠肿瘤与亲代患者肿瘤样本间的基因相似度更高（P<0.0001）。结论 成功构建了NSG小鼠和BALB/c裸鼠ESCC皮下移植瘤模型,并发现NSG小鼠对于模型成功的建立更具有优势。     

Comparative studies on radioprotection of recombinant human interleukin－1 in C_3H and BALB／c mice

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｉｅｓｏｎｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ｉｎＣ_３ＨａｎｄＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅＷｕＳｈｕｇｕａｎｇ（吴曙光）；ＴａｄａａｋｉＭｉｙａｍｏｔｏ（宫本忠昭）（１Ｉ?..     

共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究

目的 :应用转染有小鼠B7- 2基因片段的肝癌细胞 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠肿瘤生长和消退情况 ,研究共刺激分子B7- 2对肿瘤的免疫治疗作用。方法 :建立BALB/c小鼠转B7- 2基因肝癌细胞株H2 2 /B7- 2 ,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力 ;BALB/c鼠皮下接种H2 2 /B7- 2及野生型H2 2细胞H2 2 /Wt,以空载体转染细胞H2 2 /neo为对照 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小 ;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养 (MTLCs)后测定淋巴细胞增殖指数和CTLs活性 ,同时测定培养上清IL -2、IFNγ ,研究B7- 2分子的抗肿瘤免疫效果。结果 :细胞在体外增殖能力一致 (P =0 .782 ) ;当接种不同肿瘤细胞后 ,三组动物都发生肿瘤 ,接种H2 2 /B7- 2组肿瘤形成有迟发性 ,并在接种 18d后肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种H2 2 /Wt和H2 2 /neo组动物肿瘤呈进行性生长。H2 2 /B7- 2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显强于对照细胞 (P <0 .0 5 )。结论 :共刺激分子B7- 2能增强肝癌细胞的免疫原性 ,它在抗肿瘤早期发挥作用。用其治疗肝癌是有效的 ,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应。     

重组人白细胞介素—1的辐射防护作用的种属差异

重组人白细胞介素-1α(rhI1-1α,IL-1)对C3H和BALB/c小鼠的辐射防护作用有明显的种属差异。在C3H小鼠产生防护作用的IL-1剂量显著高于BALB/c小鼠的剂量.IL-1能增加BALB/c和C3H小鼠早期多能造血干细胞(CFU—S_(12))的数目,但C3H小鼠的CFU—S_(12)对IL-1的反应性低于BALB/c小鼠。BALB/c小鼠的骨髓基质细胞层在无TL-1存在时能很好地维持骨髓细胞的生长,而C3H小鼠的骨髓基质细胞层需有IL-1的存在才能维持骨髓有核细胞的生长。上述事实提示,IL-1对C3H和BALB/c小鼠的辐射防护作用存在种属差异。     

禽流感病毒感染BALB/c小鼠的动态病理观察

目的 将H5N1亚型禽流感病毒(AIV)鼻腔接种BALB/c小鼠,动态观察小鼠每个时期主要器官组织的病理变化.方法 将100μl H5N1亚型禽流感病毒原液滴入经麻醉后BALB/c小鼠鼻腔,观察14 d,每天取材1次,固定、包埋、切片后HE染色观察各组织病理变化.结果 H5N1亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠后,产生一系列与禽流感病毒感染有关的动态病理改变:第1～2天(前驱期),肺轻微出血、水肿、炎性细胞浸润;第3～7天(发作期),肺损伤逐渐严重,大量出血、炎性细胞浸润、严重水肿、淤血、肺泡实变塌陷或者气肿;第8～14天(恢复期),各种损伤逐渐减轻,出血渗出减少,水肿减轻,肺间质出现纤维化而趋于恢复正常.肝、肾、脑出现病理改变.结论 通过动态观察病理,弄清了禽流感病毒每个时期在BALB/c小鼠体内造成的病理损伤.     

苦参碱对小鼠H22细胞抗肿瘤作用的实验研究

目的:观察苦参碱在体内和体外的抗肿瘤作用.方法:MTT法检测苦参碱对小鼠腹水瘤细胞H22的体外杀伤作用;Annexin V-FITC/PI双标记法检测苦参碱对体外培养的H22细胞的诱导凋亡作用;在BALB/C小鼠H22移植瘤模型上观察苦参碱的体内抑瘤活性,透射电镜观察苦参碱治疗后荷瘤小鼠肝癌细胞的超微结构改变;免疫组化法检测荷瘤小鼠肝癌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达.结果:苦参碱在体外能够明显抑制H22细胞的生长和增殖,并可诱导细胞凋亡;对小鼠肿瘤生长也有明显抑制作用,高、低浓度组抑瘤率分别为60.71%和62.53%;用药组小鼠肿瘤组织中,电镜下可见较为典型的细胞凋亡的形态学改变;肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达增强,与荷瘤对照组相比有显著性差异(P＜0.01).结论:苦参碱在体内外对H22肿瘤细胞生长均有抑制作用,同时可促进肿瘤细胞表达Bax蛋白,抑制Bcl-2表达,诱导肿瘤细胞凋亡.     

sPD-1蛋白治疗小鼠H22肝癌的实验研究

目的:观察sPD-1蛋白对小鼠H22肝癌腹水瘤生长的抑制作用。方法:建立H22肝癌小鼠腹水瘤模型,将24只接种H22肝癌细胞BALB/c小鼠随机分成3组,其腹腔分别注射PBS(模型组)、DDP(阳性对照组)以及sPD-1蛋白,用药15 d后,停止用药,取腹水测定腹水细胞Treg细胞的产生情况,并观察小鼠的毒副反应以及生存期。结果:sPD-1蛋白组的H22肝癌生命延长为(25.75±4.30)d,DDP组的H22肝癌生命延长为(25.00±4.41)d,均明显高于对照组的(16.63±2.67)d(P<0.05)。sPD-1蛋白组小鼠腹水中Treg细胞明显少于DDP组和模型组,免疫水平优于DDP和PBS组。结论:原核表达的sPD-1蛋白对小鼠H22肝癌腹水瘤的生长具有明显抑制作用,并能促进机体免疫系统功能,提高生存期。     

雪旺细胞外泌体影响胶质瘢痕形成修复小鼠脊髓损伤的实验研究

目的:探讨雪旺细胞外泌体（SCDEs）对小鼠脊髓损伤的修复作用。方法:从小鼠坐骨神经中提取原代雪旺细胞,并将雪旺细胞培养上清分次超速离心得到雪旺细胞外泌体。透射电镜鉴定外泌体 ,尾静脉注射外泌体,每周2次,每次3 μL/只,BMS评分观察小鼠行为学功能恢复,免疫荧光染色观察外泌体神经保护作用和胶质瘢痕变化情况。结果:SCDEs的直径范围为40~100 nm;与PBS组相比, SCDEs组行为学BMS评分增加（P<0.05）,神经学功能指标有所恢复（P<0.01）,胶质瘢痕增加（P<0.01）。结论:SCDEs可以促进损伤后胶质瘢痕的增加,修复脊髓损伤。     

甘草多糖对H22荷瘤小鼠的免疫调节作用

目的：建立H22荷瘤小鼠模型,观察甘草多糖对模型小鼠脾脏调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）及脾淋巴细胞转化率的影响,探讨甘草多糖的免疫调节机制。方法：50只Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、环磷酰胺组、甘草多糖组和甘草多糖加环磷酰胺组。除正常组外,其余各组建立H22荷瘤小鼠模型。造模第2天各组开始给药,正常组和模型组腹腔注射生理盐水,环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺1周,甘草多糖组颈后皮下注射甘草多糖,连续14 d。取脾制备脾单细胞悬液,用流式细胞仪检测脾调节性T细胞,四甲基偶氮唑盐比色法检测脾淋巴细胞转化率。结果：模型组小鼠Treg细胞比例明显高于正常组,甘草多糖组Treg细胞比例低于模型组（P〈0.01）,甘草多糖组脾淋巴细胞转化率明显高于环磷酰胺组。甘草多糖与环磷酰胺无交互作用。结论：甘草多糖可能通过降低荷瘤小鼠Treg细胞的比例及提高脾淋巴细胞转化率而发挥抗肿瘤免疫调节作用。