鼠源性抗人IgM μ链单克隆抗体的制备和鉴定

目的:建立能稳定分泌高效价抗人IgM μ链单克隆抗体的细胞株,收获并纯化抗体用于进一步研究.方法:小鼠免疫脾细胞与骨髓瘤细胞用PEG融合,小鼠体内诱生腹水的方法收获大量单克隆抗体,辛酸硫酸铵提纯,并鉴定其纯度.结果:获得3个稳定分泌抗体的细胞株M1、M2、M3,鉴定其亚类分别为IgG3、IgG2a、IgG1;腹水抗体纯化后获得纯化抗体含量分别为0.36 mg/ml、0.28 mg/ml、3.71 mg/ml.结论:用PEG进行细胞融合,辛酸硫酸铵盐析法纯化能够获得较高效价和纯度的抗体.     

人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选

目的获得稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法以CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞,体内诱生腹水法大量制备单抗。捕获ELISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果成功建立了一株分泌抗CAP单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞4D10。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1,杂交瘤染色体数目90-110条,间接ELISA检测诱生小鼠腹水的抗体效价达1∶2.56×105,纯度达95%,该细胞连续培养生物学性状稳定。结论成功制备的抗氯霉素单克隆抗体4D10效价高、纯度高,为利用该单抗研制检测氯霉素残留试剂盒提供原材料。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶Dusp23单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶23(Dusp23)单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp23功能的研究奠定基础。方法以纯化的原核表达Dusp23为免疫原,免疫BALB/c小鼠,待免疫小鼠血清效价满足融合需要,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化建立可稳定分泌抗Dusp23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将细胞株打入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,用ProteinG亲合层析柱纯化所得腹水获得纯化抗体,ELISA及Western-blot检测抗体的效价和亲和力,并用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。利用纯化后的两株单克隆抗体对临床收集的肝癌组织标本进行免疫组化分析。结果筛选到2株(N012和N013)可以稳定分泌人双特异性磷酸化酶23(Dusp23)单克隆抗体的细胞株,并对其进行纯化和鉴定,两株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:5120和1:2560,腹水效价分别为1:25600和1:12800,以肝癌细胞HepG2和重组Dusp23蛋白为抗原,利用纯化后的两株抗体Western-blot鉴定结果均在预期位置出现阳性条带。两株杂交瘤细胞分泌抗体的亚型鉴定N012和N013均为Ig...     

高效价抗人血红蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高效价抗人血红蛋白(Hb)单克隆抗体并对其进行鉴定。方法用纯化人血红蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗人Hb单克隆抗体的细胞株,将阳性细胞株接种于小鼠腹腔制备单克隆抗体并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,分析其敏感性、特异性及纯化抗体的相对亲和力。结果共获得3株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均与人Hb有较高的亲和力,其敏感性可达0.5μg/ml,而且与人肌红蛋白(Mb)及各种动物血红蛋白、肌红蛋白均无交叉反应。结论3株单克隆抗体杂交瘤细胞株有较好的特异性,与人Hb有较高的亲和力。     

组织因子单克隆抗体及对照抗体的制备、纯化和鉴定

目的纯化组织因子(TF)单克隆抗体及对照抗体。方法给小鼠腹腔注射杂交瘤8A3和9E10细胞,产生的腹水应用凝胶过滤层析法和Protein A亲和层析法纯化组织因子抗体及对照抗体,并用SDS-PAGE和BCA法检测纯化后单克隆抗体的纯度及蛋白浓度。结果单抗纯化后电泳重链和轻链都呈一条带,TF抗体和对照抗体的最终浓度分别为0.7726mg/ml和0.8592mg/ml。结论应用层析法和凝胶过滤和Protein A亲和分离层析法纯化抗体,能够得到纯度较高的单克隆抗体。     

ARMET的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的 制备抗人ARMET(arginine-rich,mutated in early stage of tumors)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 将pET28a-ARMET转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,用预装好的Ni-beads柱进行纯化,通过SDS-PAGE电泳及考玛斯亮蓝染色方法 判断融合蛋白的表达量及纯度.将纯化的ARMET免疫雌性BALB/c小鼠后采用淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌抗ARMET杂交瘤细胞株.体内诱生腹水法制备mAb,间接ELISA法测定其效价及抗体亚型,辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb.用免疫荧光双标及Western blot法对抗体的特异性进行了鉴定.结果获得了纯度较高、浓度较高的融合蛋白;建立了7株稳定分泌特异性抗ARMET mAb的杂交瘤细胞株,诱生腹水法获得的抗体效价在1×10-5～1×10-7之间.且均有较好的特异性.结论 已成功制备出抗ARMET mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究奠定了基础.     

具有中和功能的抗单体C-反应蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用

目的:制备单体C-反应蛋白(monomeric C-reactive protein,mCRP)的单克隆抗体。方法:用合成的人C-反应蛋白末端八肽氨基酸,与牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例融合,间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;制备腹水抗体;采用Protein G亲和层析法纯化抗体,用间接ELISA和Western blot方法测定抗体特异性,并采用该单抗研究其对mCRP干预的乳大鼠心肌细胞的保护作用。结果:得到1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化后的单克隆抗体纯度达98%,抗体活性良好,并且该抗体可以降低mCRP导致的心肌细胞TGF-β的表达。结论:成功获得1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其初步应用进行了鉴定,并证实其可以中和mCRP引起的心肌细胞的损伤作用。     

抗人肺腺癌杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

用人肺腺癌细胞株AGZ—83a常规免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,获得一稳定分泌抗人肺腺癌单克隆抗体（McAb）的杂交癌细胞林──—QMC－WL99。制备并纯化了小鼠腹水抗体,腹水效价为5.5X106,亚型鉴定为IgG1。免疫组化结果显示QMC－WL99单抗的特异性较高,与肺腺癌有较好选择反应性,与正常组织无交及反应。该单克隆抗体的亲和常数为7.25×1010M－1,液氮冻再后复苏,杂交瘤细胞株QMC－WL99分泌抗体的能力不受影响。     

人降钙素原的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的: 原核表达人降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,制备高纯度的PCT单克隆抗体。方法: 将构建的PCT-pET22b表达载体转入大肠埃希菌BL21中诱导表达PCT蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化,用蛋白质印迹法和胶体金法对其进行鉴定。获得的PCT重组蛋白采用长程免疫法皮下多点注射Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞（SP2/0）融合,筛选阳性杂交瘤细胞株并进行亚克隆4次。将细胞株注入小鼠腹腔收集腹腔积液获得单克隆抗体,经辛酸硫酸铵法和Protein G亲和层析法进行纯化。结果： SDS-PAGE电泳结果显示在相对分子质量约14 kDa处有一明显条带,与目的蛋白大小相符。蛋白质印迹法和胶体金法证明该可溶性蛋白为PCT。采用细胞融合技术成功筛选出7株阳性杂交瘤细胞,将其命名为B3,C4,C7,E9,F8,F10,G2。选B3和C4细胞株通过体内诱生法制备单克隆抗体,经纯化后纯度可达95%以上。间接ELISA法检测B3、C4抗体效价均可达10⁷,亲和常数分别为5.06×10⁸,7.3×10⁸。结论： 获得高纯度的PCT重组蛋白及其单克隆抗体,为PCT检测试剂盒的进一步研究提供了支持。     

抗HLA-B27单克隆抗体的制备鉴定及初步应用

目的：制备HLA－B27单克隆抗体。方法：用HLA－B27抗原免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，用ELISA法筛选分泌该单抗的细胞株。结果：建立了分泌该单抗的细胞系3B3和4F2，抗体均为IgG2b,3B3细胞分泌的单抗只与B27反应，而4F2细胞分泌的单抗与B7有交叉反应。结论：建立了高特异性分泌抗B27单抗的细胞株，具有潜在的应用价值。     

抗钠泵α2亚单位截断性片段多肽抗体的制备与鉴定

目的采用多肽制备技术和免疫学技术制备抗钠泵α2亚单位截断性片段及其抗体,为检测和研究钠泵α2亚单位的组织学
分布及其功能研究提供实验基础。方法根据NCBI-Genebank 获得大鼠钠泵α2 亚单位M1~M2 膜外区截断性片段目的多肽
（LAAMEDEPSNDN）,采用9-氟甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成目的多肽,并采用碳化二亚胺法制备出多肽与孔戚血蓝素复
合物,免疫新西兰大白兔,免疫4次后获得抗血清,测定其效价。随后采用protein A纯化IgG抗体,并将其用于大鼠主动脉血管
平滑肌细胞钠泵α2 亚单的组织学检测。结果（1）人工合成的大鼠钠泵α2 亚单位截断性片段长13 氨基酸残基
（LAAMEDEPSNDN-C）,理论相对分子质量：1408.48,质谱实测相对分子质量：1407.90;高效色谱分析纯度HPLC纯度>85.5%;
（2）ELISA法检测免疫后兔子的抗血清效价均大于1∶512 000,蛋白A亲和纯化获得亲和纯化抗体浓度为0.965 mg/ml,按照1∶
1000稀释（终浓度1 μg/ml）,ELISA检测抗体效价为1∶256 000;（3）该抗体按照1∶100~1∶200稀释可用于免疫细胞学检测。结
论成功制备高效价抗钠泵α2亚单位截断性片段抗体可用于钠泵α2亚单位的ELISA和免疫细胞化学实验,为钠泵α2亚单位的
组织细胞学检测和功能研究提供新的实验基础。
     

Preparation of monoclonal antibody against HPT and its application to detecting marker protein in genetically modified rice

INTRODUCTION The enzyme hygromycin B phosphotransferase(HPT) is a selectable marker used widely in variousanimal and plant transformation systems. It hasproven that hpt is a highly effective marker gene forrice transformation in comparison with the traditionalkanamycin antibiotic gene (nptII)[1]. On the otherhand, cowpea trypsin inhibitor from cowpea seeds[2],a member of the serine protease inhibitor family, isresistant to a wide range of insects. Constitutiveexpression of the cpti gene…     

抗人ζ珠蛋白链不同表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备和鉴定抗ζ珠蛋白链单克隆抗体。方法 用纯化的重组ζ珠蛋白链免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤,经重组的ζ珠蛋白链筛选和3次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得3株杂交瘤细胞1A12、3H9及4D11,其分泌单抗的亚型分别为IgG2a、IgG1和IgG1;双抗体夹心ELISA结果证明3株单抗均可结合重组的及东南亚(--^SEA)缺失型地中海贫血基因携带者血中的ζ珠蛋白链,且其中1A12和3H9识别的位点为不同表位。这三株抗体将为筛选地中海贫血基因携带者的免疫检测提供有力工具。     

Analysis of TRAIL receptor expression using anti-TRAIL death receptor-5 monoclonal antibodies

Objective To establish hybridomas that produce anti-death receptor-5 (DR5) monoclonal antibodies(mAbs) and check the surface expression of DR5 (sDR5) on cell lines.Methods The cDNA of human DR5 was cloned into pGAPZa. Recombinant Pichia pastoris clones generated via homologous recombination secreted high levels of sDR5. The sDR5 was purified using a nickel ion column. BALB/c mice were immunized with sDR5 and spleen cells were fused with the SP2/0-Ag 14. Monoclonal antibodies were tested by ELISA for their abilities binding to sDR5 and by flow cytometry for the reactivities to surface DR5 of Jurkat cells. Surface expression of the TRAIL receptor was determined by flow cytometric analysis measuring the binding of anti-DR5 mAb.Results Isotypes of mAbs were determined to be IgG1 and IgM, all of which were reactive to sDR5 as observed through ELISA. It was discovered using flow cytometry that only IgG was able to bind to DR5 on the plasma membrane of Jurkat cells, sDR5 was found to completely inhibit anti-DR5 mAb binding to Jurkat cells. Approximately 95% of Jurkat cells, 98% SW480, 99% U937, 100% U87,86% HCT116, 64% HL-60, 47% HeLa and 13% K562 cells express membrane DR5.Conclusions These results demonstrate that anti-DR5 mAb is able to specifically bind to DR5 and that DR5 is expressed at high levels on Jurkat, SW480, U87, U937 and HCT116 cell lines, and at medium levels on HL-60 and HeLa cell lines. The expression of DR5 on K562 cell line is low.     

抗人ξ珠蛋白链不同表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备和鉴定抗ξ珠蛋白链单克隆抗体。方法用纯化的重组ξ珠蛋白链免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤，经重组的ξ珠蛋白链筛选和3次克隆化，从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论获得3株杂交瘤细胞IA12、3H9及4D11，其分泌单抗的亚型分别为IgG2a、IgG1和IgG1；双抗体夹心ELISA结果证明3株单抗均可结合重组的及东南亚（--^SEA）缺失型地中海贫血基因携带者血中的ξ珠蛋白链，且其中IA12和3H9识别的位点为不同表位。这三株抗体将为筛选地中海贫血基因携带者的免疫检测提供有力工具。     

恶性疟原虫单克隆抗体保护性机制的实验研究

用体外抑制试验、调理试验和细胞毒试验等方法,对抗恶性疟原虫红内期McAb之功能特性进行了研究。17株McAb中有7株对同步化培养的恶性疟原虫的体外增殖具有明显的抑制作用;抑制强度取决于剂量和作用时间。在McAb—IgG浓度为0.6mg/ml时,上述7株McAb的抑制活性均在94％以上。在6株McAb中,有4株能促进巨噬细胞吞噬疟原虫而发挥调理作用。在7株McAb中,有4株能加强腹腔细胞杀伤和杀死疟原虫而表现出细胞毒活性。结果提示,恶性疟原虫McAb似有“多功能”、“双功能”和”单功能”之分,用“多功能性McAb”纯化的疟疾抗原,在制备疟疾亚单位疫苗方面可能更有意义。     

抗前列腺癌/抗CD3双特异性单链抗体的构建及表达

目的 构建并表达抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体,观察其生物学活性及临床意义。方法 利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术,构建抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体融合基因,测序正确后,利用EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达,表达产物纯化后,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果 经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为1．5kb,序列与设计完全一致;SDS-PAGE和Western印迹实验证明：表达产物分泌于细胞培养上清,相对分子质量为6l000;流式细胞仪结果显示：双特异性单链抗体与PBMC和PC-3细胞的阳性结合率分别为54．1％和53．7％。结论 抗前列腺癌／抗人CD3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性,为进一步的体内实验奠定了基础。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。