人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的构建人乙酰肝素酶（HPSE）基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体，并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNAHPSE启动子核心片段，并测序鉴定和分析转录因子结合位点（TFBS）。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP—Hp及质粒pEGFP-1（阴性对照）和pEGFP—N1（阳性对照）分别转染正常人脐静脉内皮细胞（ECV）和不同的肿瘤细胞（肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞）。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561bp，序列分析与GenBank收录一致，含有3个SPI、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N—mye和NGFI—p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP—Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示，转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达；转染pEGFP—N1细胞均有强荧光表达；转染pEGFP—Hp质粒的ECV几乎无荧光表达，HepG2和Hep2细胞有较强荧光，K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明，pEGFP—Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3．9％、21．3％、10．8％和6．5％，pEGFP-N1转染率分别为17．1％、24．0％、14．0％和11．0％，二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体，该载体可在肿瘤细胞特异性表达，但其活性需进一步加强。     

Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体的构建及其肿瘤靶向干扰作用研究

目的：构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、hTERT基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-hTERT,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法：化学合成hTERT基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-hTERT;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-hTERT,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot 技术检测MCF-7细胞和Hela 细胞中hTERT mRNA和蛋白的表达。结果：重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中hTERT mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制（P<0.05）,两组之间无明显差异（P>0.05）。结论：Survivin启动子调控的hTERT基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中hTERT的表达,而对正常细胞不产生影响。     

乙型肝炎病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

为研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达。用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子，载入T载体，测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1。构建出HBV不同启动子调控的EGFP基因表达载体，经酶切、测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将4种构建好的载体转染肝癌细胞株HepG2，用倒置荧光显微镜观察各重组体转染细胞中EGFP的表达。     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段，并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段，经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTERTp重组质粒，瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5，检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb，DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40），片段长度为1084bp；采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功；hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达，而正常细胞则均为阴性；瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性，在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性，hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体，观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段，克隆至pEGFP—N1；用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体；用脂质体法，将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402；分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功；该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达，并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达，绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选，并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

含dMAR真核表达载体的构建及影响EGFP表达的研究

目的　研究dMAR对EGFP基因表达的调控作用。方法　用Kpn -I酶切pGFP/MAR,回收含MAR下游850bp的片段dMAR,与Kpn I酶切回收的pEGFP-C1 载体连接,Hind Ⅲ酶切鉴定方向,构建正向、反向连接的真核表达载体pEGFP/dMAR′和pEGFP/dMAR。将该表达载体转染COS7细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达并采用流式细胞术进行荧光定量。结果　pEGFP- C1,pEGFP/dMAR′和pEGFP/dMAR转染后48 h EGFP的表达量分别为45.1%、40.5%和11.3%。结论　pEGFP/dMAR显著抑制了EGFP的表达,pEGFP/dMAR′的增强表达作用不明显。     

survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达

目的:构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检测该启动子在Hep-2细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,置换pShuttle载体中的CMV启动子,构建质粒pSurp;分别双酶切pShuttle、pSurp和pEGFP-C1载体,构建分别携带survivin启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP;脂质体法转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:成功扩增survivin基因启动子,构建了survivin基因启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,用其转染两种细胞后,荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有表达。结论:成功克隆survivin启动子,其在Hep-2细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

前列腺组织特异性启动子介导的TAT-EGFP的靶向表达

目的〓〖HTK〗构建由前列腺特异抗原（PSA）启动子介导、表达带有蛋白转导结构域序列（TAT）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白pPSA-TAT-EGFP表达载体，使TAT所携带的目的蛋白能够在靶组织中高效表达，提高其特异性及表达效率。〖HTW〗方法〓〖HTK〗以pEGFP-1载体为模板，设计包含TAT序列的引物，PCR技术扩增含有酶切位点的小片段Sal I-TAT-EGFP-Not I，经胶回收纯化，连接到T克隆载体。双酶切及测序鉴定后，提取质粒、双酶切后胶回收得到目的小片段。 含有PSA启动子的pPSA-EGFP载体经Sal I和Not I双酶切后，胶回收含有PSA启动子序列的大片段。过夜连接目的小片段与PSA启动子大片段，得到pPSA-TAT-EGFP表达载体。转化、筛选阳性克隆后酶切与测序鉴定。将构建载体分别转染前列腺癌细胞和大肠癌细胞检测其表达情况。〖HTW〗结果〓〖HTK〗成功构建pPSA-TAT-EGFP表达载体。转染结果显示其能够在前列腺癌细胞中特异性表达。〖HTW〗结论〓〖HTK〗引入了PSA组织特异性启动子的TAT所携带的目的蛋白能够在前列腺癌组织中表达。     

以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体的构建及鉴定

目的构建以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒载体,并对其进行鉴定。方法以pEGFP-NI质粒为模板,PCR法扩增获得EGFP基因片段,并将其亚克隆入PGL3-promoter质粒骨架,得到以EGFP为报告基因的增强子鉴定质粒pEGFP-enhancer。人工合成不同拷贝的缺氧反应元件（HRE）增强子序列,插入到pEGFP-enhancer多克隆位点获得重组质粒pEGFP-HRE、pEGFP-5HR,以脂质体LipofectamiIle2000转染Hela细胞,常氧与缺氧处理后以荧光显微镜及流式细胞仪观察EGFP荧光表达。结果构建的不同拷贝HRE的增强子鉴定质粒pEGFP-HRE、pEGFP-5HRE转染Hela细胞后,常氧处理绿色荧光表达无差异,缺氧处理后随HRE拷贝数增加绿色荧光表达强度增加。结论成功构建了增强子表达质粒pEGFP-enhancer,通过EGFP的表达强度可以反应增强子活性。     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.