hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。     

节律蛋白mPER1在NIH3T3细胞增殖和迁移中的作用

目的 研究PER1蛋白对NIH3T3细胞增殖和迁移的影响.方法 将重组表达质粒pcDNA3.1/mPER1转染入NIH3T3细胞中,并以未转染的NIH3T3细胞为对照,利用MTT法检测细胞增殖的改变.利用RT-PCR技术和Western blot检测节律蛋白mPER1对细胞迁移关键性蛋白基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.结果 MITT法显示PER1表达上调可以抑制NIH3T3细胞增殖,RT-PCR技术和Western blot检测显示在NIH3T3细胞中,当节律蛋白mPER1表达上调时,细胞迁移关键性蛋白MMP-2在RNA和蛋白水平的表达较对照组降低.结论 上调NIH3T3细胞内的PER1蛋白表达能抑制细胞增殖以及细胞迁移的关键性MMP-2在RNA和蛋白水平的表达.     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组(P0.05)。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

溶酶体相关4次跨膜蛋白质β基因对前列腺癌细胞增殖和转移的影响

目的:研究溶酶体相关4次跨膜蛋白质β(LAPTM4B)基因在前列腺癌细胞中的表达水平和生物功能。方法:采用实时荧光定量PCR技术比较LAPTM4B在前列腺癌细胞中的表达差异。合成shRNA LAPTM4B质粒,用lipofectamine 2000介导转染前列腺癌细胞。RNA干扰技术下调LAPTM4B表达后,通过软琼脂细胞克隆形成实验、前列腺癌细胞侵袭和迁移实验研究前列腺癌细胞生物功能的改变。结果:LNCaP、DU145和PC-3细胞中LAPTM4BmRNA水平较RWPE-1明显增高,且差异具有统计学意义(P=0.001 2)。成功建立稳定转染shRNA LAPTM4B质粒和空白对照质粒的前列腺癌细胞株。LNCaP和PC-3细胞中LAPTM4BshRNA转染组细胞的体外克隆形成能力明显低于未转染组和空载体转染组,差异有统计学意义(P<0.000 1)。LAPTM4BshRNA转染组PC-3和LNCaP细胞到达对侧的迁移细胞数明显低于未转染组和空载体转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LAPTM4B在前列腺癌细胞中表达上调,下调LAPTM4B在前列腺癌细胞中表达可以抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

含重组人血小板生成素基因的小鼠成纤维细胞的克隆筛选与鉴定

目的:获取稳定表达重组人血小板生成素(thrombopoie tin, TPO)的NIH3T3成纤维细胞克隆,为开展成纤维细胞介导的TPO基因治疗研究提供细胞学基础.方法:以重组人T PO cDNA为目的基因, 构建真核细胞表达重组体pcDNA3/TPO,藉脂质体将其转染于NIH3T3细胞,经G418筛选,获得稳定表达重组人TPO的细胞克隆,应用PCR、RT-PCR及Western印迹等技术鉴定目的基因的导入及表达.结果:pcDNA3/TPO可藉脂质体转染NIH3T3细胞,转染细胞可稳定表达并分泌TPO.结论:已获得所需细胞克隆,为应用人TPO cDNA进行基因治疗奠定了基础.     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能.方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(一),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达载体peDNA3.1(一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础. G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达裁体peDNA3.1 一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明     

pEgr-sHemopexin重组质粒的构建及体外辐射诱导表达

目的：克隆小鼠分泌型Hemopexin (sPEX) 编码区的cDNA序列,构建含Egr-1启动子的pEgr-sPEX真核表达载体,检测辐射诱导重组质粒在B16F10细胞中的表达。 方法：用RT-PCR从NIH3T3细胞中扩增出sPEX,经测序证实后,构建pEgr-sPEX重组质粒,以脂质体转染B16F10细胞,用Western blotting方法检测B16F10细胞上清中辐射诱导PEX的表达。 结果：测序表明扩增的sPEX cDNA序列与GenBank中登录的序列完全一致,sPEX cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1-Egr-1,转染入B16F10细胞内PEX基因在体外辐射诱导下成功获得表达。结论：成功地克隆了小鼠sPEX基因,并在体外证实了pEgr-sPEX具有辐射诱导表达特性。     

胃肠道间质瘤中C-kit原癌基因突变体的构建及功能研究

目的:构建含突变C-kit基因cDNA的真核表达质粒并行进一步的功能分析.方法:用RT-PCR方法从人胎脑组织克隆野生型C-kit基因蛋白编码区cDNA.根据胃肠道间质瘤中检测出的C-kit基因突变序列,体外突变野生型C-kit cDNA得到突变型C-kit cDNA,与pcDNA3重组成真核表达质粒,并用脂质体法稳定转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cell,HEK)293细胞系,G418加压筛选出阳性克隆;用Western印迹法检测转染细胞KIT蛋白表达,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测转染HEK 细胞后细胞周期改变,并观察稳定转染突变型重组质粒人胚肾细胞在裸鼠内的成瘤性.分别设转染pcDNA3空白质粒和野生型的C-kit cDNA真核表达质粒的HEK细胞做为对照.结果:构建了突变型C-kit cDNA与pcDNA3的真核表达质粒; 功能检测分析表明:细胞生长曲线显示与对照组相比,实验组的生长速度明显增快;MTT比色显示,与对照组相比实验组细胞增殖活性显著增强;细胞周期检测结果显示,处于增殖期细胞(S G2-M)比例显著高于对照组;体内结果显示转染突变型C-kit基因的HEK细胞在裸鼠体内成瘤.结论:C-kit原癌基因突变体可促使人类细胞生长加快,增殖活性明显增强,并可以使更多的细胞由静止期进入增殖期, 并可使人胚胎肾细胞发生恶性转化,提示C-kit基因突变有可能是引起胃肠道间质瘤恶性转化的关键机制之一.     

Piwil2基因表达诱导NIH3T3细胞恶性转化

目的 通过建立稳定表达外源Piwil2基因的NIH3T3细胞,初步探讨Piwil2基因对NIH3T3细胞生物学特性的调控作用.方法 通过脂质体介导的方法和G418的筛选,建立稳定表达Piwil2基因的NIH3T3细胞株,之后利用细胞集落形成实验、细胞增殖实验、细胞周期分析和裸鼠成瘤实验,观察Piwil2基因表达对NIH3T3细胞的生物学特性的影响.结果 建立了稳定过表达Piwil2基因的NIH3T3细胞株.与对照组空白载体细胞系相比,过表达Piwil2基因的NIH3T3细胞增殖和集落形成能力增强;细胞周期G0/G1期减少、S期明显升高;接种裸鼠后形成的肿瘤体积显著大于对照组.结论 Piwil2基因在NIH3T3细胞中稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能.     

抑癌基因联合转染对膀胱癌细胞的生长抑制作用研究

目的　探讨抑癌基因 p5 3和 Rb对膀胱癌细胞的生长抑制作用。方法　利用逆转录病毒和电穿孔法将 p5 3、Rb单独或联合导入膀胱癌细胞株 T2 4中 ,Northern杂交等证实外源目的基因的表达后 ,观测并比较不同转染后细胞的生长、增殖水平和成瘤性等。结果　获得 p5 3、Rb单独和联合转染的 T2 4细胞 ,Northern杂交等证实 T2 4细胞中 p5 3失活而 Rb正常 ,转入的外源野生型 p5 3基因和 Rb基因均被表达。与未转染的对照组 T2 4细胞相比 ,转入 p5 3的细胞其生长速率明显降低 ,细胞增殖受抑制 ,软琼脂克隆形成能力丧失 ;而只转染 Rb的细胞除软琼脂克隆形成能力有所降低外 ,细胞生长和增殖未受明显抑制。结论　外源野生型 p5 3能抑制 T2 4生长并降低其成瘤性 ,增加 Rb的表达对细胞生长无明显抑制作用。p5 3对 T2 4细胞的生长抑制作用与外源 Rb基因导入与否无明显关系 ,Rb表达水平正常的膀胱癌细胞其异常增殖可能与 Rb蛋白磷酸化状态的关系更为密切。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

核仁磷酸蛋白突变基因表达对NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)突变基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞系体外增殖和凋亡的影响以及其分子机制。方法通过脂质体介导将真核表达载体pEGFP-C1-NPMc+转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达NPM突变蛋白细胞株,RT-PCR和Western blot检测NPM突变基因和蛋白的表达。MTT、克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;FCM检测细胞周期分布及凋亡水平的改变,并通过对周期调控因子p21及凋亡相关分子Caspase-3活性检测,初步探讨NPM突变参与细胞恶性增殖的分子机制。结果建立了稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞株。NPM-mA实验组细胞较对照组细胞增殖能力及平板克隆形成率明显增高(P<0.05);甲基纤维素集落形成实验显示各组细胞在甲基纤维素上均不能形成集落;与对照组比较,NPM-mA实验组细胞中G1期细胞比例(42.27±0.86)%显著减低(P<0.01),S期细胞比例(43.08±0.74)%显著增加(P<0.01),同时伴有p21 mRNA水平下降,稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞凋亡率(1.00±0.13)%明显降低(P<0.01),C...     

人肝癌相关新基因编码产物LAPTM4B的鉴定及其生物学特性

目的 :鉴定由肝细胞癌 (HCC)相关新基因LAPTM 4B编码的蛋白质并研究其生物学特性。方法 :以Westernblot、免疫组化及双向电泳鉴定新基因的表达产物 ;以免疫共沉淀等方法研究分子间的相互作用。结果 :LAPTM4B基因编码相对分子质量分别为 35× 10 3 和 2 4× 10 3 、等电点分别为 9.0 7和 4 .6 5的两种异型分子。它们在肝癌组织及肝癌细胞系的表达显著上调 ,而相对分子质量为 35× 10 3 者尤为明显 ,并与细胞分化程度相关。LAPTM4B蛋白可与整合素α 6亚单位及表皮生长因子 (EGF)受体形成信号复合物。结论 :LAPTM4B 35蛋白在人肝癌组织及细胞系过表达 ,并可能通过与细胞表面的整合素受体及EGF受体形成复合物而参与细胞外基质成分所启动的信号转导。     

丙型肝炎病毒NS3不同末端在COS、NIH3T3细胞中的转录与表达

目的:建立丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的COS和NIH 3T3的细胞系表达系统,以探讨其慢性化及肝癌的发病机理.方法:用脂质体共转录法,将含有丙型肝炎病毒NS 3区不同末端的重组质粒pSG 5 neo转录至COS和MH 3T3细胞系中表达,并用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和Southern blot法在DNA水平检测.用Western blot法在蛋白水平检测.结果:在转录的COS和MH 3T3的细胞系中,存在有丙型肝炎病毒NS 3在3和5基因片段,并可表达相应的抗原.结论:此表达细胞系的建立,有利于对丙型肝炎病毒的复制,丙型肝炎慢性化及肝癌发病的研究.     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

唾液酸酶NEU1 siRNA对人卵巢癌OVCAR3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的 探讨唾液酸酶1(neuraminidase,NEU1)小干扰RNA (siRNA)对人卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。 方法 将人类卵巢癌细胞OVCAR3接种于无抗生素的培养基后进行NEU1 RNA沉默处理。对照组转染加入250 μl Opti-mem无血清培养基,模型组(MOCK)转染加入245 μl Opti-mem无血清培养基和5 μl MOCK siRNA (100 pmol),实验组转染加入245 μl Opti-mem无血清培养基和5 μl NEU1 siRNA (100 pmol)。处理48 h后,收集被转染的细胞,并进行免疫印迹,细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞侵袭试验。 结果 细胞增殖试验和凋亡试验(流式细胞术)结果表明,与模型组相比,NEU1 siRNA能有效抑制癌细胞增殖,阻滞细胞周期G₀/G₁期,并且诱导细胞凋亡。Transwell实验的结果表明,经NEU1 siRNA处理过的OVCAR3细胞侵袭力被显著抑制。此外,Western blot结果表明NEU1 siRNA可抑制Cln3和Cln5的表达以及降低ATP5B和ATP5J的表达水平。 结论 NEU1 siRNA能有效抑制人类卵巢癌OVCAR3细胞的增殖、凋亡和侵袭,为卵巢癌的靶向治疗提供了一个新方向。      

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

Effect of N,N’- dinitrosopiperazine on in vitro expression of humancytochro me P450 2E1

目的：建立人细胞色素P450 2E1(CYP2E1)cDNA体外异源表达模型,观察化学致癌物二亚硝基哌嗪（N,N‘-dinitrosopiperzine,DNP）对CYPWE1表达的影响。方法：脂质体介导转染法将外源人CYP2E1cDNA导入NIH3T3细胞,PCR和Southern blot鉴定外源基因的整合,RT-PCR检测其表达;用不同浓度乙醇和DNP处理转化细胞,RT-PCR和western bloting 检测CYP2E1表达的改变。结果：获得二个具外源基因CYP2E1cDNA整合及稳定表达的细胞克隆NIH3T3-2E1-A1和NIH3T3-2E1-A8;经乙醇和DNP处理的细胞克隆CYP2E1mRNA和蛋白质水平的表达增强。结论：DNP与乙醇对CYP2E1表达的诱导可能与其mRNA转录增强有关,DNP致癌可能与CYP2E1对其原位代谢活化相关。