神经上皮干细胞粘附壳聚糖纤维生长分化的实验研究

目的 检测神经上皮干细胞与壳聚糖纤维的生物相容性,并探讨其在壳聚糖纤维材料上的生长、分化情况.方法 从胚胎神经管取材神经上皮干细胞,并与壳聚糖纤维进行体外共培养.采用MTT法检测细胞在壳聚糖纤维上的活性,采用光镜和扫描电镜技术观察细胞在壳聚糖纤维上的存活、生长状况,采用免疫细胞化学染色鉴定神经上皮干细胞的分化情况.结果 神经上皮干细胞可以贴附在壳聚糖纤维表面生长,并可分化为神经元和神经胶质细胞,细胞活性与单纯神经上皮干细胞培养组没有明显差别.结论 壳聚糖纤维与神经上皮干细胞有良好的生物相容性,二者在外周神经损伤的治疗中具有良好的应用前景.     

躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究

目的探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞在壳聚糖纤维上立体培养后复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究。方法采用孕10．5dWistar大鼠的胚胎神经管分离培养躯干神经嵴干细胞,将体外培养48h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上,观察两者的组织相容性。应用黏附有躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管桥接了缺损的大鼠坐骨神经,术后进行电生理、组织学检测,观察了周围神经再生及神经通路重建的状况。结果从神经管取材的躯干神经嵴干细胞在无血清培养基内可以大量扩增;将躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维支架材料上行扫描电镜观察,可见躯干神经嵴干细胞贴附在壳聚糖纤维表面,存活良好,表明躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维支架材料有良好的相容性;桥接手术后,电生理检测结果显示,含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖一硅胶管桥接组坐骨神经传导潜速率及波幅值显著好于单纯硅胶管桥接组（均P〈0．01）;甲苯胺蓝染色光镜观察及图像分析结果均显示含躯干神经嵴千细胞的壳聚糖一硅胶管桥接组再生轴突的髓鞘化更明显,再生纤维密度及直径等各检测指标均优于单纯硅胶管桥接组（均P〈0．01）。结论壳聚糖纤维支架材料与躯干神经嵴干细胞构建的桥接管具有良好的生物相容性,其中躯干神经嵴干细胞可分化为施万细胞,以此桥接缺损的周围神经,可促进其再生和修复。     

血清对联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞的影响

目的：探讨血清对联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞的影响，进一步寻求诱导神经上皮干细胞定向分化的影响因素。方法：采用不同浓度血清联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞，收集上清液作为条件培养液，免疫细胞化学染色观察条件培养液诱导神经上皮干细胞分化，统计分析分化为神经元与星形胶质细胞的比例；MTT检测条件培养液促Schwann细胞存活及增殖的作用。结果：Schwann细胞促进神经上皮干细胞存活和分化，随着血清浓度增加，神经上皮干细胞分化形成的神经元比例减少；神经上皮干细胞及血清均促进Schwann细胞存活和增殖，随血清浓度增加，存活及增殖率增加。结论：无血清或较低血清浓度有利于共培养的Schwann细胞存活和增殖，同时也有利于共培养神经上皮干细胞存活和向神经元方向分化。     

静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纤维支架与兔脂肪源干细胞的体外生物相容性研究

目的利用兔脂肪源干细胞评价静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纤维支架的生物相容性。方法脂肪源干细胞取自新西兰白兔皮下脂肪组织,经分离、培养后接种到待检支架上,使用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上的生长形态;MTT法比较支架上培养和常规培养条件下的脂肪源干细胞生长曲线与倍增时间。结果脂肪源干细胞在纤维支架上生长良好,生长曲线与常规培养时基本一致,两组间细胞倍增时间差异无统计学意义(P>0.05)。结论脂肪源干细胞能够在静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纤维支架材料上正常生长增殖,该支架材料生物相容性好。     

大鼠甲状腺髓样癌细胞系CA-77在不同培养条件下的生物学特性

目的：观察大鼠甲状腺髓样癌细胞系CA-77在不同培养条件下生长、增殖、降钙素（CT）及降钙素基因相关肽（CGRP）合成表达等情况，探讨CA-77细胞的培养条件。方法：分别采用DMEM，RPMI1640和DMEM/Ham'sF12(1：1)含血清培养液及无血清培养液进行CA-77细胞培养，分别绘制细胞生长曲线和CT及CGRP的免疫组化染色。结果：CA-77细胞在DMEM，RPMI1640和DMEM/Ham'Sf12(1:1)含血清培养液和无血清培养液中均可保持其良好的生物特性。结论：CA-77可以在常用培养液中培养，并可在无血清条件下保持稳定的生物特性。     

躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维组织相容性的研究

目的 探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维的相容性.方法 采用神经管植块法培养躯干神经嵴干细胞,并行免疫荧光细胞化学双重染色鉴定,将培养48h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上,观察两者的组织相容性.结果 采用神经管植块法培养的神经嵴干细胞,免疫细胞化学染色呈现neatin及P75双阳性,将其接种在壳聚糖纤维支架材料上,可见神经嵴干细胞贴附于壳聚糖纤维上生长;S-100免疫细胞化学染色显示,S-100阳性细胞突起的末端呈扁平状膨大;扫描电镜显示,壳聚糖纤维上的躯干神经嵴干细胞为梭形,呈现"端对端"、"肩并肩"排列,伸出爪形伪足贴附于壳聚糖纤维上.结论 躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维有良好的组织相容性,并可分化为Schwann细胞.     

神经干细胞增殖能力的组织差异性研究

目的从胚胎大鼠海马和上丘脑区中分离、培养神经干细胞,并进行体外增殖能力的比较。方法采用机械分离,无血清传代培养法从胚鼠海马和上丘脑获得神经干细胞。动态观察细胞生长情况,测定其体外生长曲线。使用免疫荧光法对两种来源的细胞克隆进行鉴定,激光共聚焦显微镜三维形态观察。使用扫描电镜观察神经干细胞克隆球的表面形态特征。将神经干细胞与Brdu共孵育,观察体外增殖情况。结果海马源胚胎神经干细胞的体外生长情况与上丘源干细胞基本相同,但前者的增殖速度相对较慢。两种来源的干细胞克隆球具有相似的超微结构。在相差显微镜和激光共聚焦显微镜下,两种来源的神经干细胞形态相似。与Brdu共孵育后,上丘源神经干细胞的阳性率高于海马源干细胞。从细胞生长曲线上可见两种来源的干细胞呈现了相同的增殖趋势,但生长曲线并不相同。从培养第8d起,上丘源胚胎神经细胞的活细胞记数就高于海马源干细胞。结论使用机械分离、无血清培养的方法可以获得胚胎海马源与上丘源神经干细胞,两者具有相似的形态结构,但上丘来源的神经干细胞增殖速度高于海马来源的神经干细胞。     

骨髓间充质干细胞在壳聚糖凝胶中体外三维培养的实验研究

目的研究猪骨髓间充质干细胞在壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶中体外三维培养的生长和增殖情况,探讨壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶与骨髓间充质干细胞的细胞相容性。方法将间充质干细胞与壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶混合,体外三维培养3周,采用倒置相差显微镜观察细胞在凝胶内粘附、生长和增殖等情况,复合物行组织形态学观察。结果间充质干细胞能良好地在壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶内伸展、粘附、生长和增殖,细胞在新形成的组织内保持成活。结论壳聚糖/β-甘油磷酸钠凝胶与间充质干细胞具有良好的细胞相容性,可作为间充质干细胞的载体。     

聚砜膜空心纤维透析器细胞毒性研究

目的应用聚砜膜空心纤维透析器浸提液配制的细胞培养液培养小鼠成纤维细胞L929(4×104/ml),观察其对L929细胞生长的影响。方法细胞计数法和WST-1法。结果和对照组相比,两种试验方法实验组的细胞均生长良好,细胞增殖度均大于75%,为1级反应。结论根据国家标准进行评价,该聚砜膜空心纤维透析器对L929细胞形态、生长和增殖没有影响,无细胞毒性作用,具有良好的生物相容性,符合生物材料应用要求。     

静电纺丝聚乳酸-乙醇酸聚合物膜与大鼠嗅鞘细胞的生物相容性研究

目的 探索静电纺丝技术制作的聚乳酸-乙醇酸聚合物（PLGA）膜与大鼠嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells,OECs）的生物相容性。方法 体外培养纯化成年大鼠OECs,将细胞接种于静电纺丝PLGA膜上,使用相差显微镜观察静电纺丝PLGA膜上OECs的细胞形态与分布;用CFDA SE荧光染色检测接种后1～5 d内静电纺丝PLGA膜上OECs的增殖情况;以多聚赖氨酸（PLL）包被细胞做对照。将静电纺丝PLGA膜植入大鼠体内观察其与大鼠的组织相容性。结果 体外培养纯化所得的OECs的细胞纯度大于90%。相差显微镜下示OECs在静电纺丝PLGA膜孔隙中的纳米纤维上黏附良好,细胞状态佳,且特异性地沿纳米纤维方向生长。接种后1～5 d内OECs在静电纺丝PLGA膜上均正常增殖,细胞数目与对照组相比差异无统计学意义。静电纺丝PLGA膜局部移植后大鼠无死亡,PLGA膜与周围组织融合并部分降解。结论 静电纺丝PLGA膜具有良好的生物相容性,OECs在其膜上的黏附和增殖状况良好,是有潜力的神经修复组织工程化神经移植物。     

神经干细胞对胶质瘤细胞抑制作用的实验研究

目的:探讨神经干细胞在体外对胶质瘤细胞有无抑制作用。方法:取胎鼠大脑皮层组织,于无血清培养基中进行细胞培养成神经干细胞并进行Nestin免疫荧光染色鉴定;将神经干细胞和鼠胶质瘤细胞(C6细胞)在体外混合培养,观察肿瘤细胞的生长、增殖情况及形态学变化,并对C6细胞进行FCM细胞周期分析及MTT试验。结果:培养所得的细胞特异性抗原Nestin染色呈现阳性,具有较强的分裂增殖能力和自我更新能力,表明培养所获得的细胞是神经干细胞;神经干细胞与C6细胞混合培养后,C6细胞不易贴壁,增殖慢。FCM分析显示实验组处于G0/G1期的C6细胞明显多于对照组(χ2=14.77,P<0.01)。MTT试验显示实验组光吸收值低于对照组(t=-11.66,P<0.01)。结论:胚鼠大脑皮层组织可培养出神经干细胞;在体外对胶质瘤细胞的生长有抑制作用。     

人脑神经干细胞的分离培养和鉴定

目的 探讨人脑神经干细胞的分离培养和鉴定方法。方法 采用无血清培养液从人胚胎脑皮质分离和培养神经干细胞，并应用免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向化潜能的鉴定。结果 鉴定表明从人胚胎脑皮质分离培养的细胞具有神经干细胞的特征，并可在体外增殖，经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。结论 从人胚胎脑皮质成功分离培养了神经干细胞，它是研究细胞诱导分化的良好模型。     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法，探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞，并用EGF和血清诱导其分化，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成，但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞，细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

大鼠胚胎大脑皮层源性神经干细胞体外培养及增殖分化特点

目的 建立大鼠胚脑皮层神经干细胞体外培养及鉴定技术,探讨其增殖分化特性,为应用神经干细胞移植治疗神经疾病提供基础。方法 采用含有丝分裂源表皮生长因子(EGF)的无血清培养基培养SD大鼠孕14．5d的胚胎大脑皮层神经干细胞,应用免疫细胞化学方法了解其增殖分化特性;以单细胞克隆实验及BrdU免疫标记证实神经干细胞自我增殖能力。结果 培养细胞在EGF作用下可分裂增殖,并表达神经干细胞特异性抗原nestin,分化细胞MAP2及GFAP抗原表达阳性。结论 SD大鼠胚脑皮层可分离培养出神经干细胞;并具有增殖、自我更新能力和多向分化潜能特性。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和分化

探索大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和传代等方法，并用血清促使分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞。方法从胚胎大鼠脑组织中分离得到神经干细胞；在无血清条件下，对神经干细胞进行培养、传代；用神经上皮干细胞蛋白（Nestin）对神经干细胞进行箍定；用免疫荧光方法对分化后神经干细胞进行神经纤维丝蛋白（NF68）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）和半乳糖脑苷脂（Gale）染色。结果成功得到神经干细胞，并且进行多次传代培养。血清能促使其分化成为神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下能大量增生，并且具有多向分化潜能。     

人胚脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的：探讨人胚脑神经干细胞的体外生长特性、分化情况和培养条件，为相关实验研究提供条件。方法：利用神经干细胞的条件培养基，对从9周和12周胚龄的自然流产胎儿分离的前脑、后脑进行神经干细胞培养，并比较其生长特性。以免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后神经细胞抗原的表达。结果：两胚龄前、后脑组织中均分离出神经干细胞，他们均表达Nestin抗原阳性。血清诱导分化后，表达神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。9周胚龄的脑组织原代培养形成细胞克隆的比例高于12周胚龄的脑组织。在条件培养基存在的情况下，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。结论：从人胚脑组织中的前、后脑中分离出神经干细胞，较小胚龄的脑组织原代培养时细胞克隆的形成比例较高，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。     

胚胎大鼠脑室下区神经干细胞透射电镜超微结构

目的探寻用透射电镜显示超微结构识别胚胎大鼠脑室下区神经干细胞的新方法．方法将培养了24h已贴壁生长的胎鼠脑室下区神经干细胞（已经免疫组化方法鉴定证实）经0．125％胰蛋白酶消化,待光镜下见细胞回缩,胞体变圆,细胞间隙变大时,立即加入胎牛血清终止消化,经1000r／min×10min离心沉淀,收集细胞于离心管内,弃上清后,经3．5％戊二醛、1％锇酸双固定、丙酮酸逐级脱水、618环氧树脂包埋、超薄切片后柠檬酸铅、醋酸铀双染色后透射电镜观察、摄片．结果原代培养24h的脑室下区神经细胞标本透射电镜下观察、摄片,见部分细胞体积较小,胞核大,核染色质丰富,胞质少,胞质内见大量游离核糖体,线粒体多见,其它细胞器少见．根据其细胞器幼稚,尚未发育成熟的特点,提示该类细胞为幼稚细胞,结合免疫组化实验,确定为胚胎大鼠脑室下区神经干细胞．结论透射电镜显示胚胎大鼠脑室下区神经细胞超微结构是除免疫组化外识别该神经细胞的另一种新方法,值得借鉴和推广．     

神经干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响

目的探讨神经干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响。方法分离培养新生大鼠海马神经干细胞,BrdU进行标记。采用大脑中动脉阻塞法复制脑缺血模型,动物于造模3d后侧脑室注射标记细胞,分别于1、7、14和28d处死动物,观察动物神经功能和移植细胞存活情况。结果神经干细胞能移行至缺血部位并存活,移植后缺血大鼠神经功能明显得到恢复,在14、28d与模型组差异有显著性。结论神经干细胞移植能促进局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复,是中风治疗的有效方法。     

人类神经干细胞的长期培养和传代

【目的】探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。【方法】采用机械方法从胎脑中分离神经细胞 ,应用N2培养基进行培养 ,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)刺激细胞扩增 ;传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养 ;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。【结果】从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞 ,培养条件下呈悬浮状态生长 ,形成神经球 ,绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物 ;这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞 ,早期的培养有少量的少突胶质细胞 ;在这种培养条件下 ,神经干细胞生长速度较慢 ,而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系 ,神经干细胞可获得较大的扩增速度。【结论】体外的培养条件下 ,可从胎脑组织中培养出神经干细胞 ,它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。