RhoE对cd44基因启动子的转录活性及大肠癌细胞系恶性生物学行为的影响

目的 研究RhoE对cd44基因启动子的转录调控,并探讨RhoE对裸鼠体内成瘤性的影响.方法 采用PCR技术从人胚肾HEK293细胞中扩增出cd44启动子,并将其插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入SW480及LoVo细胞中监测其活性.将pcDNA3.1-RhoE和...     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

人 PDCD4启动子真核报告质粒的构建和鉴定

目的  克隆人程序性死亡因子4(PDCD4)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性,为进一步研究PDCD4表达调控奠定基础。方法  采用PCR技术,从人基因组DNA中扩增出PDCD4启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL4-Basic中,测序所扩增的DNA序列,并将构建的pGL4-PDCD4-P1荧光素酶报告质粒,与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染OVCAR3,SKOV3细胞系,通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性。结果  测序结果表明,扩增的PDCD4启动子序列正确,pGL4-PDCD4-P1转染OVCAR3细胞(高表达内源性PDCD4) 24h后,双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL4-Basic空载体的67倍;而pGL4-PDCD4-P1转染低表达内源性PDCD4的SKOV3细胞后相对活性约为15倍。结论  成功构建了PDCD4启动子的克隆及人PDCD4启动子报告基因,为后续研究奠定了基础。     

抑癌基因BRCA1启动子荧光素酶报告基因的构建及活性测定

目的:克隆人BRCA1基因的启动子,构建荧光素酶报告基因载体,并在细胞内检其活性,为其后续基因凋控研究提供依据。方法:采用PCR技术,从人正常宫颈组织细胞中扩增出BRCA1启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,测序所扩增的DNA序列,将其转染入HCT 116细胞中并检测其活性。结果:酶切及基因测序方法证实所构建质粒含有pGL3-basic全序列及BRCA1启动子上游调控序列,扩增的BRCA1启动子序列正确;双报告基因实验检测荧光素酶活力表明,p53缺失的HCT116细胞中BRCA1启动子明显增加（P<0.05）,构建的报告基因具有启动子活性。结论:克隆BRCA1启动子及成功构建人BRCA1启动子报告基因,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，转染细胞后检测报告基因对rhBMP-2的反应，以期用于rhBMP活性的定量测定。方法 用PCR方法扩增骨钙素部分启动子147bp，克隆入pGEM-3zf(-)中，经酶切鉴定和序列分析正确后，亚克隆人能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体pcDNA3-Luc中，构建真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，然后分别将pcDNA3-Luc和pcDNA3-OCP-Luc转染细胞，并检测其对rhBMP-2的反应。结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3-Luc大为降低，而且报告基因的表达与rhBMP-2剂量在一定范围内成线性正相关。结论 真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc的报告基因表达具有特异性，可代替直接测定骨钙素用于rhBMP-2活性的定量测定研究。     

人PDLIM4基因启动子报告基因载体的构建及其在人类肿瘤细胞中的表达

目的构建人PDLIM4基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-promoter,检测其在不同肿瘤细胞中的表达。方法据Genebank中人PDLIM4基因启动子序列分别设计上下游引物,扩增其启动子片段,并插入到pGL3-Basic报告基因载体,分别得到含有3kb和1.2kb的PDLIM4基因启动子的两个报告基因质粒pGL3-PD-LIM4-3kb和pGL3-PDLIM4-1.2kb。序列为1.2kb的启动子利用Erase-a-base试剂盒,经外切酶Ⅲ从5’端逐步酶切得到5个含不同长度启动子序列的报告基因载体:pGL3-PDLIM4-1.2D1、pGL3-PDLIM4-1.2D2、pGL3-PDLIM4-1.2D3、pGL3-PDLIM4-1.2D4、pGL3-PDLIM4-1.2D5。将构建的报告基因载体分别瞬时转染以下细胞株:Hela、MDA-MB231、KB、PC-3、LNCaP,检测其荧光素酶表达活性。结果所构建质粒经酶切、测序鉴定,其片段长度及序列均正确。转染结果显示,长片段的3kb和1.2kb启动子序列在所测试的细胞株中均有表达,但在人激素非依赖前列腺癌PC-3细胞株、人激素依赖前列腺癌LINCaP细胞株中表达较低。而不同长度的启动子报告基因质粒转染PC-3、LNCaP的结果显示,pGL3-PDLIM4-1.2kb表达活性最强,pGL3-PDLIM4-970bp表达活性最弱。结论成功构建了7个分别含有不同长度的PDLIM4启动子报告基因载体,其在不同的肿瘤细胞株中均有不同程度的表达,而在前列腺癌细胞中表达较低。     

催乳素调控序列荧光素酶报告基因的构建

目的通过将人催乳素(hPRL)启动子上游的调控基因(包括启动子,-3518 bp~+15 bp)插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,构建成含催乳素调控序列的荧光素酶报告基因(PRL3400-pGL3-Basic),用于催乳素在淋巴细胞中的表达调控研究。方法将含hPRL启动子的PGEM-PRL3400,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic转染大肠肝菌(JM109)后扩增,提取并纯化PGEM-PRL3400和pGL3-Basic;分别以SacⅠ、BamHI酶切PGEM-PRL3400,SacⅠ、BglⅡ酶切pGL3-Basic;电泳并回收PRL3400片段和pGL3-Basic酶切大片段,在T4 DNA连接酶的作用下,将PRL3400片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中。结果通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒含有pGL3-Basic全序列及催乳素启动子上游调控序列,并且PRL3400片段调控序列的插入位置与方向正确。结论该荧光素酶报告基因构建成功。     

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1启动子

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白（preS2）对人酰基蛋白硫酯酶1（APT1）启动子的作用。方法生物信息学方法确定人APT1启动子序列。PCR扩增人APT1启动子和HBV preS2基因,分别插入pGL3和pcDNA3．1（－）质粒构建人APT1启动子荧光素酶报告基因质粒 pGL3‐APT1和 HBV preS2真核表达质粒 pcDNA3．1（－）‐preS2。将 pGL3‐APT1和pcDNA3．1（－）‐preS2共转染人肝癌细胞系 HepG2,然后通过检测细胞荧光素酶活性来评价 preS2对人APT1基因启动子的作用。数据用独立样本 t检验分析。结果测序结果证实pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1与实验设计相符。pGL3‐APT1的荧光素酶活性是阳性对照质粒pGL3‐Control的荧光素酶活性的1．2倍（P＜0．01）。pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1共转染HepG2细胞的荧光素酶活性为无preS2基因质粒pcDNA3．1（－）与pGL3‐APT1共转染 HepG2细胞荧光素酶活性的2．6倍（P＜0．01）。结论本研究克隆的人APT1启动子序列具有高启动子活性;HBV preS2可激活人APT1启动子。     

大鼠Caspase 8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响?同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠Caspase 8基因启动子序列(-1136~+101 nt),将Caspase 8基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将Caspase 8基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-Caspase 8-FL)和大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对Caspase 8基因的启动作用?另用生物信息学软件预测Caspase 8基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建Caspase 8基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-Caspase 8-1~4)?将上述Caspase 8基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-Caspase 8-FL和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,Caspase 8基因启动子活性显著增加?而将pGL3-Caspase 8-FL?pGL3-Caspase 8-1~4和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-Caspase 8-4的启动活性显著低于pGL3-Caspase 8-2和pGL3-Caspase 8-3?提示IRF-1可能结合在Caspase 8基因启动子的-336~-136 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠Caspase 8基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在Caspase 8基因启动子上的结合区域?     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

十二指肠损伤的治疗体会

目的：提高十二指肠损伤的诊治水平，方法：回顾总结该院1999年－2001年间收治的十二指肠损伤7例临床经验。结果：合并其他腹部脏器损伤86％（6／7），单纯十二指肠损伤14％（1／7）。损伤部位以十二指肠降部为多占71％（5／7），水平部和球部各占14％（1／7），术后并发症发生率28％（2／7）、病死率14％（1／7）。结论：掌握十二指肠损伤的特点，早诊断、早手术、术中认真探查，掌握好检查指征，选择合理恰当术式，加强术后管理，可提高治愈率。     

断指再植的护理体会

随着医疗水平的提高,显微手外科技术在各基层医院已得到广泛开展,所收治的此类患者在逐年增加.随机统计了近两年我院20份34指的病例,通过观察认为手术的成功与否不但取决于损伤的局部条件、术中的操作和术后的治疗,同时与术前、术后的护理也密不可分.对离断指及伤口的妥善处理,积极的术前准备和术后的精心护理,特别是术后对血运的密切观察,同时通过术前术后的健康教育使患者对该疾病的知识有了一定的掌握,认识了康复训练的重要性从而使功能达到最大限度的恢复.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

法乐氏四联症的外科治疗34例分析

目的：总结法乐氏四联症外科治疗经验。方法：共34例，年龄2～16岁，32例在中低温体外循环、胸部正中切口行法乐氏四联症根治术，1例在非体外循环下行改良B-T分流术，1例行根治术同时行双向Glenn分流术。结果：术后早期死亡1例，死亡原因为低心排综合征，无远期死亡。结论：本症应争取早日行根治术，肺动脉发育差者应行改良B-T分流术，右室发育不良者在行根治术同时行双向Glenn分流术，死亡原因以低心排综合征多见，应采取合适的手术方式及围术期多种方法预防。     

上颌骨牙源性囊肿刮除手术的疗效观察

目的探讨对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术的临床疗效。方法对我科在2010年1月～2017年9月收治的73例上颌骨牙源性囊肿患者行囊肿彻底刮除手术治疗,对患者术区肿胀消退、术后伤口感染、伤口愈合、牙龈再附着、术后复发、骨质改建、骨质修复等情况随访观察。结果 73例患者术后肿胀消退时间为1～4 d。73例患者术后均未发生伤口感染,伤口均一期愈合。所有患者牙龈再附着情况好,术后均未见复发。术后未见并发症。骨质改建效果好,骨质修复的效果因影像学资料过少,缺乏客观依据,暂不下有效结论。结论对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术,术后患者的恢复情况良好,值得在临床治疗上进行推广。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。