雷公藤内酯对海人酸活化的BV-2小胶质细胞NF-κB表达的影响

目的:观察雷公藤内酯对海人酸活化的小胶质细胞活化增殖的影响,进一步探索雷公藤内酯抑制海人酸活化的小胶质细胞活化增殖的分子机制。方法:倒置显微镜观察BV-2小胶质细胞的活化增殖,免疫组化方法检测BV-2小胶质细胞的NF-κB蛋白表达水平,RT-PCR检测BV-2小胶质细胞的NF-κB mRNA表达水平。结果:倒置显微镜结果显示,与对照组相比,海人酸组BV-2小胶质细胞胞体变大变圆,突起变短或消失。与海人酸组相比,雷公藤内酯干预组BV-2小胶质细胞胞体变小变瘦,突起变细长,与对照组相似。免疫组化结果显示,与对照组相比,海人酸组BV-2小胶质细胞NF-κB蛋白表达显著增加(P0.05)。与海人酸组相比,雷公藤内酯干预组BV-2小胶质细胞NF-κB蛋白表达显著降低(P0.05)。RT-PCR结果显示,与对照组相比,海人酸组BV-2小胶质细胞NF-κB mRNA表达水平显著增加(P0.05)。与海人酸组相比,雷公藤内酯干预组BV-2小胶质细胞NF-κB mRNA表达水平显著降低(P0.05)。结论:雷公藤内酯提取物可抑制小胶质细胞活化增殖,其分子机制可能与下调小胶质细胞NF-κB蛋白和mRNA表达有关。     

雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠神经元caspase3和caspase9蛋白表达的影响

目的 :通过检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达,探讨雷公藤内酯抑制神经元凋亡的机制。方法 :结晶紫染色观察海马神经元形态,免疫组化法检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平。结果 :结晶紫染色结果显示,海人酸组中,海马神经元变性或丢失,胞体皱缩,形态不规则。雷公藤内酯干预组中海马神经元的数量和形态与对照组相似,胞浆清晰淡染,核仁清楚。免疫组化染色显示,与对照组比较,海人酸组海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著增高(P<0.05);与海人酸组相比,雷公藤内酯干预组神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著减少(P<0.05)。结论 :雷公藤内酯可下调海人酸致痫大鼠海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达,从而抑制神经元凋亡。     

雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠脑海马区水通道蛋白 4表达的影响

目的 探讨雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠海马区水通道蛋白4（AQP4）表达的影响.方法 30只SD大鼠随机分成三组：对照组、海人酸组、雷公藤内酯干预组,每组10只.海人酸组颈内皮下注射海人酸,剂量为10 mg/kg;雷公藤内酯干预组在海人酸注射前连续7d腹腔内注射雷公藤内酯,剂量为30 μg/kg;对照组注射等量的生理盐水.造模成功后取脑海马组织,应用RT-PCR和Western blot法检测各组动物海马区AQP4蛋白的表达.结果 Western blot结果显示,海人酸组和对照组AQP4条带与GAPDH条带的灰度值比分别为0.872±0.141和0.453±0.078,海人酸组AQP4表达显著增多（P＜0.05）;雷公藤内酯干预组中海马AQP4蛋白相对灰度值比为0.647±0.185,表达较海人酸组减少（P＜0.05）.RT-PCR结果显示,海人酸组与对照组AQP4条带与GAPDH条带的灰度值比分别为1.212±0.115和0.843±0.091,海人酸组AQP4 mRNA表达比对照组显著增加（P＜0.05）;雷公藤内酯干预组AQP4 mRNA相对灰度值比为1.105±0.192,与海人酸组比较明显减少（P＜0.05）.结论 雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠脑海马区AQP4蛋白的表达有下调作用,可以作为临床难治性癫痫的候选药物之一.     

雷公藤内酯醇对AD细胞模型核因子κB表达的影响

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以记忆减退、认知障碍、人格改变为临床特征的中老年中枢神经系统退变性疾病,发病机制至今尚未完全阐明。β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)沉积激活胶质细胞引发脑内炎症反应在AD的发生发展中扮演着重要角     

海人酸活化的小胶质细胞H_2O_2、NO的分泌对海马神经元谷氨酸含量的影响

目的:初步探讨海人酸(KA)活化培养的新生SD大鼠小胶质细胞(MG)及其分泌的一氧化氮/过氧化氢(NO/H2O2)、海马神经元、谷氨酸(Glu)之间的相互关系。方法:以KA作为MG的激活剂,以一氧化氮合成酶(NOS)的抑制剂氨基胍(AG)或过氧化氢的水解酶(CAT)作为工具药,先检测原代分离纯化培养的MG在KA激活后及工具药作用后各组条件培养液中NO和H2O2含量的变化,再用各组小胶质细胞条件培养液孵育离体海马神经元,观察其对神经元内Glu表达的影响。结果:KA作用后各组条件培养液中NO和H2O2含量明显升高,经AG或CAT处理后各组条件培养液中NO和H2O2含量显著降低;海马神经元的Glu免疫反应性KA组较对照组明显增强,在AG+KA组和CAT+KA组较KA组明显减弱。结论:活化的MG可能通过氧化损伤机制作为参与癫痫发作一个重要环节,提示采取抑制小胶质细胞活化、减少氧化损伤也可能是癫痫防治研究的一个重要方向。     

雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠海马区P-糖蛋白表达的影响

目的：探讨雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠海马区神经元的作用及对P-糖蛋白表达水平的影响。方法：30只SD大鼠随 机分成3组,其中对照组10只,海人酸致痫组10只,雷公藤内酯干预组10只。应用结晶紫染色观察海马神经元的形态变化,Western-Blot法检测海人酸致痫后6,24,48,72 h海马区P-糖蛋白表达水平的变化。结果：结晶紫染色结果显示,雷公藤内酯 干预组中海马神经元的数量和形态与对照组相似;海人酸致痫组中,海马神经元变性或丢失,胞体皱缩,形态不规则。Western-Blot结果显示,雷公藤内酯干预后48 h下调P-糖蛋白作用明显,海人酸致痫组中海马区P-糖蛋白表达水平与对照组比较 显著增多（P〈0. 05）;雷公藤内酯干预组中海马区P-糖蛋白表达水平与海人酸致痫组比较显著减少（P〈0.05）。结论：雷公 藤内酯对海人酸致痫大鼠海马神经元具有保护作用;雷公藤内酯对癫痫大鼠P糖蛋白的表达有一定抑制作用。     

雷公藤内酯醇对Aβ_(1-42)激活的小胶质细胞一氧化氮释放和诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的研究雷公藤内酯醇(triptolide,T10)对β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)1-42激活的小胶质细胞一氧化氮(nitrogenmonoxidum,NO)的产生及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响。方法用不同浓度的T10(10-11、10-10、10-9、10-8mol/L)预孵育小胶质细胞12 h,然后加入10μmol/L Aβ1-42共孵育12 h;Griess反应检测上清NO的含量,Western blotting检测iNOS蛋白的表达。结果 Aβ组iNOS的表达和NO释放明显高于对照组(P<0.01)。T10可明显减少Aβ诱导的小胶质细胞iNOS的表达及NO的释放(P<0.05)。结论 T10可抑制Aβ1-42激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达及NO的释放。     

OX-42和Fos蛋白在海人酸致癫大鼠前脑中早期的表达变化

目的:研究大鼠在海人酸(KA)导致癫痫发作早期前脑内小胶质细胞的变化及其与神经元的关系.方法:应用免疫组织化学法单标分别显示前脑内OX-42和Fos蛋白表达的时间规律,并用免疫组织化学双重标记显示OX-42和Fos阳性细胞的相互关系.结果:在KA致大鼠癫痫发作早期(从15 min到360 min),前脑的小胶质细胞OX-42表达阳性,随着存活时间的变化,OX-42的阳性反应经历逐渐升高又降低的过程;反应强弱:120 min组>360 min组>60 min组>30 min组>15 min组.Fos蛋白在神经元和小胶质细胞中均表达阳性,也呈现逐渐升高又降低的变化,但Fos阳性小胶质细胞出现高峰的时间早于Fos阳性神经元,各组间Fos阳性神经元数量差异均有统计学意义(P<0.01).OX-42阳性小胶质细胞和Fos阳性神经元在前脑主要分布于大脑皮层、海马、杏仁核等部位,两者的分布特征基本一致.结论:小胶质细胞可能和神经元一起参与了KA所致癫痫发作早期的变化.     

雷公藤内酯对癫痫大鼠P-糖蛋白表达影响

目的：研究海人酸致痫大鼠模型中P-糖蛋白（P—gP）表达水平的变化及雷公藤内酯干预对其的影响。方法：84只SD大鼠随机分成3组,其中对照组28只,海人酸致痫组28只。雷公藤内酯干预组28只。应用Western—Blot法检测各组动物海人酸致痫后6、24、48、72h海马区P-gp的表达,RT—PCR法检测各组动物各时间点P—gPmRNA的表达。结果：雷公藤内酯干预组海马区各时间点P—gp及P—gpmRNA的表达均较海人酸致痫组显著下调（P〈0．05）,且雷公藤内酯干预后48h下调P—gp作用明显。结论：雷公藤内酯对海人酸致痫大鼠耐药有逆转作用,其机制与下调致痫大鼠海马区P-gp的表达有关。     

炎性细胞因子对大鼠小胶质细胞整合素表达的影响

目的 探讨炎性细胞因子对大鼠小胶质细胞整合素表达的影响.方法 体外分离培养和纯化大鼠小胶质细胞,在无血清培养基培养加入不同的炎性细胞因子,应用流式细胞术检测炎性细胞因子对大鼠小胶质细胞MHC I类分子和整合素表达的影响.结果 在培养基中加入TNF、IFN-α和IFN-γ后,大鼠小胶质细胞MHC I类分子的表达较对照组均显著增加(P＜0.001);小胶质细胞α4亚基的表达较对照组分别增加(37.0%±4.1%)(P＜0.01)、(56.3%±5.3%)(P＜0.005)和(54.0%±6.1%)(P＜0.01);Mac-1(即αMβ 2)表达较对照组分别增加(34.3%±3.4%)(P＜0.01).(43.3%±5.9%)(P＜0.05)和(46.0%±3.1%)(P＜0.05).在培养基中加入TGF-β1后,MHC I类分子的表达相对于对照组显著下降(P＜0.001);小胶质细胞α4亚基的表达较对照组下降显著(P＜0.005);Mac-1较对照组下降(28.0%+5.0%)(P＜0.05).在培养基中加入TGF-β1、TNF、IFN-α和IFN-γ后,LFA-1(即αLβ2)表达均显著增加(P＜0.01).在培养基中联合加入TNF+TGF-β1、IFN-α+TGF-β1、IFN-γ+TGF-β1后,LFA-1(即αLβ2)表达均增加(P＜0.001).结论 炎性细胞因子TNF、IFN-α和IFN-γ可以促进小胺质细胞的活化,促进小肢质细胞表达α4αβ1,和Mac-1.而TGF-β1抑制小胺质细胞活化,抑制小胶质细胞表达α4β1和Mac-1.并且TGF-β1的抑制作用强于TNF、IFN-α的促进作用.炎性细胞因子(TGF-β1、TNF、IFN-α和IFN-γ)均可上调LFA-1的表达.     

雷公藤内酯对海入酸致痫大鼠神经元caspase3和caspase9蛋白表达的影响

目的：通过检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达,探讨雷公藤内酯抑制神经元凋亡的机制。方法：结晶紫染色观察海马神经元形态,免疫组化法检测海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平。结果：结晶紫染色结果显示,海人酸组中,海马神经元变性或丢失,胞体皱缩,形态不规则。雷公藤内酯干预组中海马神经元的数量和形态与对照组相似,胞浆清晰淡染,核仁清楚。免疫组化染色显示,与对照组比较,海人酸组海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著增高（P〈0．05）;与海人酸组相比,雷公藤内酯干预组神经元caspase3和caspase9蛋白表达水平显著减少（P〈O．05）。结论：雷公藤内酯可下调海人酸致痫大鼠海马神经元caspase3和caspase9蛋白表达．从而抑制神经元凋亡。     

胎大鼠脑内小胶质细胞的分离纯化和鉴定

 摘要：目的 分离纯化和鉴定胎大鼠脑内小胶质细胞,为小胶质细胞的研究奠定基础。方法 利用盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法分离纯化胎大鼠脑内小胶质细胞,免疫荧光技术及流式细胞技术鉴定小胶质细胞的纯度。结果 通过盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法,得到98%纯度的小胶质细胞。结论 盐酸利多卡因注射液联合震荡培养法是一种能获得较高纯度胎大鼠脑内小胶质细胞的方法。     

脊髓小胶质细胞激活对SNI模型大鼠神经病理性疼痛的影响

目的观察小胶质细胞对大鼠坐骨神经分支选择性损伤(SNI)所致神经病理性疼痛的影响。方法选择雄性SD大鼠64只,随机分为4组(n=16):假手术组(Sh组);模型组(SNI组);模型 米诺环素40mg/kg组(Mb组);模型 米诺环素10mg/kg组(Ms组)。其中Mb和Ms组从造模前1d起连续7d每日2次腹腔注射相应剂量的米诺环素。分别记录全组动物在术前1d及术后1,3,5,7,14d的机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射持续时间(TWD)作为大鼠疼痛行为学指标;各组大鼠分别在术后1,3,5,7,14d随机选取4只处死,取脊髓,用免疫荧光的方法检测脊髓小胶质细胞标志物OX-42的表达。结果SNI组从术后1d起即出现明显MWT降低和TWD延长,与术前及Sh组术后各时点比较均有统计学差异(P<0.05);Mb组和Ms组与SNI组相应时点比较MWT降低和TWD延长程度有显著性差异(P<0.05);Mb与Ms组比较MWT降低和TWD延长程度有统计学差异(P<0.05);Mb、Ms组与SNI组比较脊髓OX-42的表达减少,并呈剂量依赖性。结论米诺环素腹腔注射可剂量依赖性的减少OX-42的表达,抑制脊髓小胶质细胞的激活,减轻痛觉超敏和痛觉过敏,提示小胶质细胞的活化参与SNI神经病理痛的形成。     

TSA对发育期大鼠癫痫后脑损伤的保护作用及其机制

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑素A(TSA)在癫痫后脑损伤发病中的作用及其机制。方法将32只雄性SD大鼠随机分为4组:对照组、海人酸(KA)组、小剂量TSA干预组(0.03 mg/kg)及大剂量TSA干预组(0.1 mg/kg)组,通过腹腔注射海人酸(KA)制作发育期大鼠癫痫模型,TSA于KA诱导癫痫前2 h腹腔注射给药,评估惊厥发作的等级及记录惊厥的潜伏期。癫痫后24 h处死大鼠,HE染色观察脑组织病理变化;TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡;CD68染色检测活化的小胶质细胞;Western blot检测IL-1β和TNF-α蛋白的表达。结果KA组均达到Ⅳ~V级惊厥发作,而TSA干预组能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期。HE染色可见KA组明显的神经元凋亡及细胞水肿,伴有较多的炎症细胞浸润,而TSA干预组能减轻神经元凋亡及细胞水肿,同时减少炎症细胞浸润。与对照组比较,KA组神经元凋亡数、小胶质细胞活化数及炎症因子的表达均显著增加(P<0.05),而TSA能抑制KA诱导的改变。相对于0.03 mg/kg TSA干预组,0.1 mg/kg TSA干预组治疗作用更明显(P<0.05)。结论TSA能抑制癫痫后海马神经元凋亡、小胶质细胞活化及炎症因子的表达,同时能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期,从而对癫痫后脑损伤起到保护作用。     

高效液相色谱测定大鼠血浆中雷公藤甲素含量的方法改进

目的改进以高效液相色谱测定大鼠血浆中雷公藤甲素含量的方法。方法采用乙酸乙酯萃取的方法处理血浆。色谱柱为Agilent HC C18，流动相为乙腈-水（23：77），流速为1．0ml／min，检测波长为221nm，进样量为20ul。结果雷公藤甲素检测浓度在12．5～200ng／ml范围内线性关系良好（r=0．9997），最低检测限为3ng／ml，方法的相对回收率为88．6％-98.3％，日内和日间41KSD〈10％．样品冻-20℃冰箱10天内稳定性良好。结论本方法操作简便，灵敏度和精确度高．重现性好，适于雷公藤甲素的体内药物浓度测定和药动学研究。     

雷公藤内酯醇抗心脏移植排斥反应的实验研究

目的验证雷公藤内酯醇的抗移植排斥反应作用。方法应用小鼠同种异位心肌移植模型。结果和结论雷公藤内酯醇可明显延长移植心的存活期,其免疫抑制效果与用药剂量和给药时机有关,术后给药可明显延长移植物存活期。     

雷公藤甲素对肝细胞癌中侧群细胞的影响

目的 探讨雷公藤甲素(triptolide,TPL)对肝癌侧群细胞是否有影响.方法 给予不同浓度的TPL处理人肝癌细胞SMMC-7721,利用烟酸己可碱33342染色流式细胞术检测肝癌细胞系SMMC-7721中侧群细胞的比例;利用流式细胞术分选出侧群细胞,再分别通过体外细胞球体形成实验及NOD/SCID小鼠体内移植瘤成瘤实验,验证TPL对于肝癌侧群细胞成球及成瘤能力的影响.结果 TPL可减少SMMC-7721细胞中侧群细胞的比例[DMSO组(9.5±0.2)％,TPL 10 nmol/L组(3.4±0.3)％,TPL 25 nmol/L组(1.1±0.1)％,P＜0.01],并且可以抑制肝癌侧群细胞的成球能力[成球数DMSO组(29±4)个,5 nmol/L TPL组(12±2)个,10 nmol/L TPL组(4±1)个,P＜0.01)]及成瘤能力(抑瘤率为76.5％).结论 雷公藤甲素能够减少肝癌中侧群细胞的数量,并能抑制其功能,可能是其抑制肝癌的机制之一.     

雷公藤内酯醇对小鼠H22腹水瘤细胞凋亡及PD\|L1表达的影响

目的 探讨雷公藤内酯醇诱导H22腹水瘤细胞凋亡以及作用机制。 方法 采用腹腔注射肝癌H22细胞建立小鼠腹水瘤模型,80只成模小鼠随机分为对照组、雷公藤内酯醇低、中、高剂量(0.05, 0.1, 0.2 mg/kg)组,每组20只。观察小鼠体质量变化、生存期; 计量腹水体积及计数腹水内肿瘤细胞数; 流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡及程序性死亡受体-配体1(PD-L1)表达的变化。 结果 与对照组比较,雷公藤内酯醇3个剂量组小鼠的体质量增长缓慢,生存期中位数均有显著延长(P<0.01); 雷公藤内酯醇低、中、高3个剂量组的腹水体积以及每毫升中的肿瘤细胞数均显著低于对照组(P<0.05); 流式细胞术检测结果显示,不同剂量的雷公藤内酯醇可以显著诱导H22细胞凋亡并下调H22细胞PD-L1的表达(P<0.05,P<0.01)。 结论 雷公藤内酯醇可能通过诱导肝癌H22细胞凋亡及抑制PD-L1表达,发挥抗肝肿瘤的作用。