新生大鼠心肌细胞分离、纯化及培养方法的改进

目的 应用酶消化法消化心室肌组织,培养心肌细胞,探索获得高存活率和高纯度心肌细胞的培养条件,为生理学和药理学研究提供细胞模型.方法 胰蛋白酶和胶原酶I联合消化新生大鼠心室肌组织,控制消化时间和消化温度;用差速贴壁法和化学抑制法纯化心肌细胞进行体外培养.荧光显微镜观察心肌细胞形态学变化;流式细胞仪检测肌钙蛋白Ⅰ的表达;Fluo-3/AM进行细胞质内游离钙离子染色.结果 培养的心肌细胞4 h后开始贴壁生长,24 h后有少数单个细胞出现自发性节律性搏动,之后连接成片,细胞簇同步收缩,细胞形态、结构完整;肌钙蛋白Ⅰ阳性率为91%;所有心肌细胞细胞质内钙离子染色阳性,荧光强度随细胞搏动呈强弱周期性变化.结论 应用酶消化法可简单快捷地获得大量活力好、纯度高的心肌细胞,为心血管相关研究提供良好的实验模型.     

新生大鼠心肌细胞分离、纯化及培养方法的改进

目的应用酶消化法消化心室肌组织,培养心肌细胞,探索获得高存活率和高纯度心肌细胞的培养条件,为生理学和药理学研究提供细胞模型。方法胰蛋白酶和胶原酶Ⅰ联合消化新生大鼠心室肌组织,控制消化时间和消化温度;用差速贴壁法和化学抑制法纯化心肌细胞进行体外培养。荧光显微镜观察心肌细胞形态学变化;流式细胞仪检测肌钙蛋白Ⅰ的表达;Fluo-3/AM进行细胞质内游离钙离子染色。结果培养的心肌细胞4 h后开始贴壁生长,24 h后有少数单个细胞出现自发性节律性搏动,之后连接成片,细胞簇同步收缩,细胞形态、结构完整;肌钙蛋白Ⅰ阳性率为91%;所有心肌细胞细胞质内钙离子染色阳性,荧光强度随细胞搏动呈强弱周期性变化。结论应用酶消化法可简单快捷地获得大量活力好、纯度高的心肌细胞,为心血管相关研究提供良好的实验模型。     

乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养

目的：探讨一种简便、可靠的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞培养方法。方法：以组织块酶消化法分离细胞,通过差速贴壁分离法收集、培养乳鼠心肌细胞和成纤维细胞。普通光学显微镜观察心肌细胞和成纤维细胞的基本特征及生长特性的变化。结果：心肌细胞12 h基本贴壁、1－3天形成细胞簇并出现同步搏动,心肌细胞纯度为93%;心肌成纤维细胞第3－6代细胞生长良好,纯度达98%以上。结论：建立的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞体外培养方法是成熟、可靠的。     

乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定

目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块,用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞,再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化,并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色,用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定,而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90 min基本贴壁,贴壁较早,培养第3～5代细胞生长良好,72 h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚,24 h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象,48 h后细胞逐渐展开,72 h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动,心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞,此方法成熟、稳定、有效,为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。     

昆明小鼠胎鼠心室肌细胞的原代培养

目的 探讨胚胎小鼠心室肌细胞分离培养的方法及细胞的存活状况.方法 采用胰蛋白酶消化心室肌细胞,差速贴壁2 h纯化心肌细胞培养,台盼蓝染色判定心肌细胞存活率.结果 心室组织4～6次基本消化完全,48 h观察细胞存活率大于90%,生物倒置显微镜下观察,24 h时有少部分细胞搏动,48 h时细胞交织成网,搏动呈同步性,搏动频率30～150次/min.结论 用胰蛋白酶消化法可以成功地分离小鼠胎鼠心室肌细胞,可获得形态、活力良好的心室肌细胞.     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

表皮真皮分离方法的探索

目的探索一种适合细胞培养的分离真表皮的酶消化法.方法将分离酶配成0.1%、0.2%、0.5% 3个浓度,在4 ℃或37 ℃条件下消化头皮或包皮,摸索消化的时间,并与0.25%胰蛋白酶消化法进行对比.结果 0.5%分离酶在4 ℃条件下消化16～18 h,或37 ℃条件下消化1 h,能够很好地分离表皮与真皮,再用胰蛋白酶将表皮游离成角质形成细胞,活细胞率高,培养后细胞融合时间短.结论分离酶能够选择性消化基底膜成分而起到很好的分离表皮与真皮的作用,分离酶和胰蛋白酶联合消化法是一种非常理想的分离角质形成细胞的方法,同时又能够避免成纤维细胞的污染.     

乳小鼠心肌细胞体外培养方法的优化

目的探讨乳小鼠心肌细胞分离和体外培养的方法,并结合实际情况建立一种优化的体外培养乳小鼠心肌细胞的方法。方法胰酶-Ⅱ型胶原酶混合液分次消化乳小鼠心肌组织后行差速贴壁法达到心肌细胞纯化目的,并利用心肌细胞特意表达a-肌动蛋白的特性运用细胞免疫组织化学方法鉴定心肌细胞。结果差速贴壁48h后心肌细胞贴壁完全,并见大部分贴壁细胞出现搏动,但未观察到同簇搏动,经a-肌动蛋白细胞免疫组织化学鉴定,心肌细胞纯度达96.7%。结论本研究优化了原代乳小鼠心肌细胞分离和体外培养方法,为后续细胞实验打下了基础。     

人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

人牙周膜细胞原代培养及鉴定

目的 建立人牙周膜细胞原代培养方法.方法 取因正畸需要拔除的健康前磨牙根面中1/3的牙周膜组织,分别运用组织块法(n=12)、酶消化法(n=10)及组织块一酶消化联合培养技术(n=12)培养人牙周膜细胞.运用免疫组化染色法对培养细胞的生物学特征加以鉴定.绘制生长曲线,观察细胞生长并计算细胞群体倍增时间.结果 组织块法、酶消化法和织块一酶消化联合培养的细胞培养成功率分别为16.67%、20.00%和33.33%.培养细胞的抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;碱性磷酸酶染色阳性.细胞生长曲线有明显的滞留期、指数生长期和平台期,群体倍增时间为109.79 h.结论 成功进行人牙周膜细胞的原代培养,培养细胞具有牙周膜细胞的生物学特征.组织块-酶消化联合培养可提高人牙周膜细胞原代培养的成功率.     

二氮嗪后处理对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞保护作用的体外研究

目的研究线粒体ATP-敏感性钾通道（mitoKTP）开放剂二氮嗪（diazoxide,DZ）后处理对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞的影响。方法体外培养原代成年大鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型,随机分为5组：Normal组（在CO2培养箱中持续培养6h）;H／R组（缺氧3h复氧3h）;DZ组（缺氧3h复氧3h,在复氧5min时给予100mol／LDZ）;DZ＋5-羟葵酸盐（5-hydmxydecanoate,5-HD）组（缺氧3h复氧3h,在缺氧末给予100mol／L选择性mitoK。通道阻断剂5-HD,然后在复氧5min时给予100mol／LDZ）;5-HD组（缺氧3h复氧3h,在缺氧末给予100mol／L5-HD）。复氧3h末检测各组培养基中乳酸脱氢酶（LDH）漏出量和丙二醛（MDA）含量,TUNEL法测定心肌细胞凋亡指数、测定心肌细胞收缩幅度。结果与Normal组相比,其他4组培养基中LDH漏出量和MDA含量明显升高,心肌细胞凋亡指数也显著增高,心肌细胞收缩幅度降低（P〈0．05）;与H／R组比较,DZ后处理使培养基中LDH漏出量及MDA含量减少、心肌细胞凋亡指数降低,复氧后心肌细胞收缩幅度明显增高（P〈0．05）,但是缺氧末即刻给予5-HD可以逆转DZ的作用（P〈0．05）;5-HD组与H／R组相比各指标差异无统计学意义（P〉0．05）。结论Dz后处理可以通过开放mitoK。通道对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞发挥保护作用。     

血必净注射液对心肺复苏后大鼠心肌肌钙蛋白T、心肌细胞Ca2+水平的影响

目的探讨血必净注射液对大鼠心肺复苏后心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌细胞Ca2+水平及心肌病理改变的影响。方法建立心肺复苏大鼠模型,并将其随机分为3组,假手术组(大鼠在麻醉后仅行气管切开插管、颈动脉血管穿刺,而不进行窒息及心肺复苏试验,n=6)、模型组(大鼠在心肺复苏即刻通过尾静脉缓慢注射生理盐水4mL/kg,n=6)、血必净组(大鼠在心肺复苏即刻通过尾静脉缓慢注射血必净注射液4mL/kg,n=6)。检测心肺复苏前、后各组cTnT值、Ca2+荧光强度平均值及心肌病理变化。结果心肺复苏后6h,模型组、血必净组大鼠心肌细胞Ca2+荧光强度平均值高于假手术组(P<0.01)。与心肺复苏前比较,心肺复苏后6h模型组、血必净组大鼠的cTnT值均明显升高(P<0.01),尤以模型组升高幅度最大。血必净组大鼠心肌损害较模型组轻。结论血必净注射液可通过抑制心肌细胞钙超载,下调cTnT水平而发挥保护心肌的作用。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法

目的探讨乳鼠心肌细胞的原代培养方法,更好地获取高存活率、高搏动率及高纯度的心肌细胞,以建立良好的原代心肌细胞研究模型。方法无菌状态下取出生3 d以内Wistar乳鼠心室肌,以混合消化酶（0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合液）反复进行短时间多次消化,用差速贴壁法纯化心肌细胞,并加入5-溴脱氧尿嘧啶抑制非心肌细胞分裂增殖,2 d后首次换液,以后隔日换液。结果心肌细胞24 h左右已基本贴壁,并可见单个细胞搏动,2～6 d形成单层心肌细胞和其细胞簇的同步搏动,经培养所获细胞搏动良好,存活率高,免疫组化鉴定显示培养的心肌细胞纯度95%以上。结论该方法是一种较为理想的乳鼠原代心肌细胞培养方法,值得进一步推广。     

Effects of 3-aminobenzamide on expressions of poly（ADP ribose） polymerase and apoptosis inducing factor in cardiomyocytes of rats with acute myocardial infarction

Background Poly（ADP-ribose） polymerase （PARP） plays an important role in cell survival and death. However, the mechanisms involved are not fully understood. Therefore, we investigated the effect of inhibition of PARP on acute myocardial infarction （AMI） at different time points in rats. Methods AMI was induced in rats by ligating the left anterior descending coronary artery. One group received 3-aminobenzamide （3-AB, a kind of PARP inhibitor） （30 mg/kg） by intraperitoneal injection. The changes of ultramicrostructure of cardiocytes in infarction region were noted, PARP cleavage was measured by Western blotting, and expressions of protein of PARP and apoptosis inducing factor （AIF） were measured by immunohistochemical staining after treatment with 3-AB for 2 hours, 4 hours, 6 hours, 1 week, 4 weeks and 8 weeks. Results Few damages to the ultramicrostructure of cardiocytes were observed after treatment with 3-AB. PARP cleavage was detected as early as 4 hours and markedly increased by 6 hours following AMI without 3-AB, but was not found until 6 hours following AMI treated with 3-AB. There were significant differences between 3-AB and AMI groups at the same time points. The expression of PARP was observed gradually increased, but that of AIF was suppressed for 6 hours after treatment of 3-AB, compared with AMI groups in positive cells at the same time points. There was significantly less cleavage of PARP and more PARP expression in 3-AB treated group compared with AMI and control groups at all matched time points. Conclusions Our results suggest that 3-AB inhibits degradation of PARP, increases the expression of PARP protein, and suppresses the expression of AIF protein. Inhibition of PARP activity may protect cardiocytes in rats with AMI and reduce apoptosis.     

Dynamic study on superficial blood flow in patients with acute myocardial infarction]

Fourteen points superficial bloodflow (SBF) of the skin and tongue in 55 patients with acute myocardial infarction (AMI) were measured at 12, 24, 36, 48, 60 hours and 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28 days after AMI by LDF (PF2). The dynamic study on multiple points SBF of 576 times showed that (1) The mean SBF of skin was 1.0 +/- 0.04 (V) at 12 hours after AMI. It occupied 70.5% in the normal control. After therapy at 48 hours of AMI, the mean SBF was increased to 1.20 +/- 0.03 (V), and approximated 85.9% of the control. (2) The mean SBF in patients with cardiogenic shock was 1.04 +/- 0.05 (V), and it was significantly lower than that without complications (P less than 0.01). The mean SBF showed a negative correlation with the nailfold microcirculatory values (P less than 0.0025). There was a negative correlation between "Tanzhong" SBF and cardiac muscle enzyme CPK, GOT, LDH (P less than 0.05). (3) The SBF of acupuncture point "Tanzhong, Erxin" related to the heart might more sensitively represent the cardiac condition in AMI. (4) The SBF of tongue was negatively correlated with GOT (P less than 0.05). (5) Continual peripheral microcirculatory observation and electrocardiographic monitoring would be helpful in the diagnosis and treatment of earlier complications of AMI in order to reduce the mortality.     

生物反应器内再造组织工程化心肌的实验研究

目的：在体外模拟以微策略条件下构建心肌细胞-胶原复合体,探索组织工程化心肌组织体外再造的可行性。方法：采用顺序消化及差速贴壁法从1-2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞,并将其与多孔胶原复合形成复合体。复合体在旋转生物反应器（rotary cell culture system,RCCS）中进行培养,观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化,并将其与正常心肌和常规培养的复合体进行比较。结果：在RCCS中培养的复合体内的细胞具有心肌细胞的特殊超微结构,免疫组化显示其中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性,与静止培养的复合体细胞相比,细胞代谢更加旺盛。结论：采用组织工程技术可以在RCCS中培育出组织工程化心肌组织。     

三种培养原代滑膜成纤维细胞方法的比较

［摘要］目的　比较3种体外分离培养原代类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞（RASFs）的方法,寻求获得快速有效的培养途径．方法　将来自关节镜RA滑膜切除术的滑膜组织分别采用胶原酶消化法、改良组织块法、双酶消化法进行培养．采用倒置相差显微镜观察细胞形态及生长特性,以Vimentin组织化学法进行鉴定．台盼兰计数培养14d后所得活细胞数目．结果　3种原代分离培养方法均可成功培养出RASFs,符合RASFs的形态特征,Vimentin阳性细胞＞95%,其中:胶原酶消化培养法分离的RASFs16-20d细胞汇合度可达70%,约４周汇合度95%;改良组织块法分离的RASFs10～14 d细胞汇合度可达70%以上;双酶消化法分离的RASFs约４周细胞汇合度达85%．处理相同数量滑膜组织获得活细胞数目比较,改良组织块法组为（1.60±0.08）×106个,胶原酶消化法组（1.41±0.08）×106个,双酶消化法组（1.19±0.05）×106个,差异有统计学意义（P＜0.05）．培育原代RASFs细胞所需时间比较,胶原酶消化法需（267.50±16.58）min,双酶消化法需（183.75±11.08）min,改良组织块法需（149.10±13.71）min,差异有统计学意义（P＜0.05）．结论　改良组织块培养法能最大限度地利用滑膜组织,获得最多数量原代RASFs细胞,是建立体外RA细胞模型最高效、快捷的方法．     

肾损伤分子1和白细胞介素18在体外循环心脏术后急性肾损伤中的应用研究

目的:探讨尿中肾损伤分子1(kidney injury molecule-1,KIM-1)和白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)在体外循环心脏手术后急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)中的应用。方法:119例体外循环心脏手术患者,根据AKI诊断标准分为AKI组和非AKI组,分别采集患者手术前后不同时间点的血液和尿液标本,采用酶法进行血肌酐(Scr)测定、ELISA法进行尿KIM-1和尿IL-18测定。结果:119例体外循环心脏手术患者术后,有29例患者在24~48h内Scr绝对值升高≥26.4μmol/L,或Scr较基础值升高≥50%,符合AKI诊断标准,AKI发生率为24.3%。与术前相比,AKI组患者尿KIM-1术后4h开始升高、尿IL-18术后6h开始升高,差异均具有统计学意义(P0.01)。尿KIM-1和尿IL-18与血Scr呈正相关,相关系数分别为0.886和0.812(P0.01)。尿KIM-1在AKI诊断中ROC曲线下面积为0.855,95%可信区间为0.717~0.993(P0.01);尿IL-18在AKI诊断中ROC曲线下面积为0.823,95%可信区间为0.661~0.985(P0.01)。结论:检测尿KIM-1和尿IL-18对于体外循环心脏手术患者发生AKI的早期诊断及预后判断具有重要意义。     

创伤性休克兔血清肌钙蛋白Ⅰ的动态变化及其应用价值

目的:探讨血清肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)对创伤性休克家兔心肌损伤的诊断价值.方法:按Lamson's法建立创伤性休克家兔模型.随机将16只大白兔分成两组(对照组和休克组)每组8只.检测休克前、休克后0.5 h、1.5 h、3 h和4 h5个时间点血清cTnⅠ的水平,观察创伤性休克家兔在休克过程中cTnⅠ的动态变化.并于4 h后打开家兔胸腔,取部分心肌组织制成标本,电镜观察心肌细胞结构的变化.结果:休克组家兔休克后各时间段血清cTnI明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01).电镜下可见心肌肌丝元明显收缩,肌浆网扩张,部分肌丝断裂、溶解、线粒体聚集,间质血管腔内炎性细胞浸润等结构的变化.结论:创伤性休克兔存在心肌损伤,cTnⅠ是判断创伤性休克兔心肌损伤灵敏可靠的指标.