PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的 建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具。方法利用Cytomegalovirus (CMV) 启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况。PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的。结果显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应。结论成功建立了表达PiggyBac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物。     

哺乳动物转座因子系统创立

<正>复旦大学发育生物学研究所的科研人员将一种源于飞蛾的PB转座因子用于小鼠和人类细胞的基因功能研究,在世界上首次创立了一个高效实用的哺乳动物转座因子系统。这篇题为“PB转座因子在哺乳动物细胞和小鼠中的高效转座”的研究论文作为封面文章于2005年7月21日发表在国际顶级生物科学杂志《细胞》上。《细胞》杂志审稿人评价这项研究是“里程碑式的发现,将可能在世界范围内改变小鼠遗传学研究,并有用于人类治疗的前景”。转座因子是一类可以进入基因组内不同位置的基因载体。科学家利用它们插入基因导致突变以了解基因功能,也     

利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选

目的：利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sgRNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法：构建PB?TRE?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo载体,与PB?CAG?rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系;构建核受体基因sgRNA病毒文库,并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系,筛选对顺铂具有抵抗性的克隆,并进行目的基因的测序鉴定。结果：挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株,在5个基因位点上可以进行高效编辑;感染sgRNA文库之后,挑选顺铂耐药的克隆,并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA,经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论：利用PiggyBac转座子系统,构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑,并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。     

人溶菌酶转基因小鼠乳汁的抑菌活性及稳定性研究

目的 研究表达人溶菌酶转基因小鼠乳汁的抑菌活性及稳定性.方法 取重组人溶菌酶(rhLYZ)表达的母鼠乳汁和人初乳,以平板扩散法检测乳样的抑菌谱.转基因小鼠乳汁的稳定性研究,系通过将乳样置于不同温度的水浴中加热,测定其溶菌活性;将稀释乳样调节到不同的pH值,或者加入不同种类的金属离子,分别测定酸碱度和金属离子对乳汁抑菌活性的影响.结果 人溶菌酶转基因小鼠乳汁对多种革兰阳性及阴性细菌具有不同程度的抑制作用,并具有很强的热稳定性、广泛的pH活性范围,金属离子对其活性的影响较小.结论 人溶菌酶转基因小鼠乳汁和人初乳有较相似的生物学活性,是动物乳"人乳化"的良好模型.     

利用Mini-Tn5转座子诱导弗氏枸橼酸杆菌插入突变的研究

目的　研究以自杀性质粒pUT携带的Mini Tn5转座子对弗氏枸橼酸杆菌进行转座诱变。方法　转座采用双亲本接合法 ,对获得的接合子进行无抗性选择条件下的连续传代测定其稳定性 ,并测其氨苄青霉素耐性及进行质粒提取以排除质粒传代原因造成假阳性的可能。对接合子进行营养缺陷株和运动突变株的筛选。结果　Mini Tn5Km转座率约为每受体菌 9 2× 10 - 6 ,接合子在无抗性选择的情况下培养 3代仍保持稳定 ,卡那霉素抗性不消失 ,说明插入到染色体上的转座序列是稳定传代的。接合子的抗性是染色体而非质粒编码的结果。对营养缺陷株的筛选和分析提示 ,转座子的插入是随机的 ,弗氏枸橼酸杆菌染色体中无明显的转座插入热区。使用该转座子能有效筛出运动突变株。结论　Mini Tn5系列转座子适于大规模筛选弗氏枸橼酸杆菌突变株。     

pTn5GFP转座质粒用于耐药鲍曼不动杆菌生物被膜相关基因的研究

【立论依据】 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一种革兰氏阴性球杆菌,是引起院内感染的主要菌种之一,多重耐药和泛耐药AB菌株感染更是给临床治疗带来极大的困难。生物被膜形成能力与AB耐药以及致病性密切相关。寻找AB生物被膜形成的关键基因对于AB相关疾病的预防和控制具有重要意义。转座子是一段特殊的DNA片段,在转座酶的作用下,可随机插入细菌基因组,使插入基因失活,改变相关表型。应用转座子随机突变策略可以找出特定表型对应的基因,但是以传统的抗生素抗性基因作为报告基因显然不能满足对多重耐药菌株的研究。 【设计思路】 绿色荧光蛋白(GFP)因为不需要单独加入底物并且易于观察而被广泛用来标记生物分子或细胞。已有研究表明,GFP基因插入细菌的染色体上后,可以有效地对细菌进行标记。基于转座质粒以及GFP的特点,本研究拟构建具有Tn5转座子和GFP基因的pTn5GFP转座质粒,利用GFP作为报告基因,构建临床分离的多重耐药AB突变文库,进而筛选出AB生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【实验内容】 以pGFPmut3.1质粒为模板,扩增GFP基因,将其连接入含有Tn5转座子的pRL27质粒,构建pTn5GFP转座质粒。利用该质粒对多重耐药AB菌株进行转座子突变,构造突变文库。对突变株的生物被膜情况进行分析,确定转座子插入位点,找出生物被膜形成的关键基因,并对其功能进行研究。 【材料】 临床多重耐药AB两株,R005和R036,自北京大学人民医院获得。常用工具菌E.coli CC118λπ和E.coli DH5α。pRL27和pGFPmut3.1质粒由原实验室毕业研究生提供。 【可行性】 已成功构建了pTn5GFP转座质粒,该质粒在容纳菌株E.coli CC118λπ具有绿色荧光表型,并已通过预实验初步确定了两株多重耐药AB生物被膜形成能力和最适实验条件。 【创新性】 本研究将GFP报告基因的便捷性以及转座质粒的转座性结合起来,有效解决了因耐药性而无法对泛耐药菌株构建突变文库的问题,结果直观,易于筛选,可行性高。     

卵胞质内单精子注射与转座子介导的转基因技术

通过卵胞质内单精子注射(ICSI)已经成为治疗人类不育症和小鼠生殖生物学研究的一种有效手段.而且ICSI介导的转基因作为一种动物转基因技术,仍然不够完善.但是相比传统的原核注射技术,该技术最大的优势是可以导入较大片段的外源基因(比如人工酵母染色体YAC).最近研究者们又发展了一种ICSI与转座子结合的转基因技术,能够高效地生产转基因后代,其效率几乎可以与慢病毒载体法相媲美,值得在转基因动物研究中加以推广和应用.     

siRNAs介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默机制,是一古老的细胞反应通路,其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用.近年来,短链RNA干扰(siRNAs)已成功地应用于哺乳动物中,该文就其介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展进行综述.     

Tn7转座子在大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌及鳗弧菌中的应用

Tn7转座子是一种定点插入型转座子,固定地插在细菌的glmS基因下游的attTn7位点,而glmS基因与细胞壁的合成有关,存在于所有的细菌中,所以Tn7转座子可以插入到所有细菌的染色体,因此Tn7转座系统已被开发为细菌基因组改造的重要工具。为了方便对大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌和鳗弧菌的改造和研究,探讨应用Tn7转座子对其基因组进行改造的操作步骤,并利用阿拉伯糖启动子pBAD诱导的Flp/FRT系统建立了高效、快捷的抗性消除方法。     

转TNF—a基因肿瘤浸润淋巴细胞的构建及其生物学特性的研究

目的用肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因转染人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL),构建转基因TIL,对其生物学特性进行研究,为肝癌基因治疗奠定基础.方法用逆转录病毒载体将TNF-α基因导入人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞,构建一种新型的抗肿瘤效应细胞-转基因TIL.对转基因TIL的增殖能力和细胞表型进行检测,用RT-PCR检测目的基因的表达,TNF-α试剂盒检测TNF-α分泌量,用MTT法检测转基因TIL体外抗肿瘤活性.结果转基因TIL的增殖活性及细胞表型与IL-2活化的TIL相似,转基因TIL 可持续表达TNF-α,其分泌量每24 h达370 pg/5×105 cells.转基因TIL对肝癌细胞株BEL7404 具有较高的杀伤活性.结论转基因TIL维持较高的稳定性,可持续表达TNF-α,具有良好的体外抗肿瘤作用,对肝癌治疗具有良好的应用前景.