应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

三种方法提取金黄色葡萄球菌DNA的比较

目的对三种金黄色葡萄球菌DNA提取方法的效果进行比较,以期获得一种简便、经济的提取方法。方法采用改良SDS法、NP40法和细菌DNA试剂盒法分别提取同一浓度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,利用Nano Drop 2000核酸检测仪测定核酸浓度和纯度,纯度用核酸在波长260 nm处的吸光值与在波长280 nm处的吸光值的比值A260/A280表示,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量;提取不同浓度梯度的金黄色葡萄球菌ATCC25923细菌DNA,PCR扩增16S r DNA片段检测并比较三种方法的灵敏度。结果三种方法提取金黄色葡萄球菌所得核酸浓度差异有统计学意义(χ~2=6.25,P0.05),NP40法提取浓度较高,改良SDS法较低。试剂盒法提取的DNA纯度较高,A_(260)/A_(280)值在1.8~2.0之间;NP40法提取纯度较差;DNA电泳结果表明SDS法和TIANGEN试剂盒法提取的DNA条带清晰,无拖带现象,NP40法未出现DNA主带,且有拖带现象。所有方法所得DNA经PCR扩增均出现阳性条带。NP40法提取DNA的PCR检测敏感度最高,为1.5×10~6 cfu/ml,改良SDS法敏感度最低,为1.5×10~8 cfu/ml。结论 NP40法提取DNA成本低,耗时少,灵敏度高,适用于金黄色葡萄球菌的快速初筛。     

4种提取口腔产黑色素细菌DNA方法的比较

目的 比较4种提取口腔产黑色素细菌中间普氏菌DNA的方法,即酚-氯仿法、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)提取法、Chelex-100提取法及试剂盒.方法 分别记录OD260、OD230、OD280及OD340值;聚合酶链反应(PCR)电泳,检测提取DNA的浓度、纯度及对PCR反映体系的影响.结果 试剂盒及CTAB法去除黑色素比较差异无统计学意义(P＞0.05),两者与酚-氯仿及Chelex-100法比较差异有统计学意义(P＜0.05);CTAB法提取DNA的浓度及纯度的效果要优于试剂盒,差异有统计学意义(P＜0.05),PCR电泳条带清晰,无拖带.结论 CTAB法可有效去除黑色素及其他杂质,同时获得较高浓度的DNA样品;黑色素并不溶于氯仿/异戊醇混合液,对PCR反应体系有很大影响.     

用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA

目的 观察用Chelex-100从微量血痕中提取DNA的效果。方法 40份血痕纱布,取血痕3 mm×3mm置于1.5 mL离心管中,采用5％Chelex-100加煮沸法,提取血痕纱布中的DNA。提取液经过紫外分光光法测定,测其A260/280的比值,计算提取液DNA的纯度和浓度;DNA提取液经微型琼脂糖凝胶电泳,检测其DNA电泳带。结果 Chelex-100能快速在1 h之内提取微量血痕中的DNA,其提取液DNA纯度:27.5％样品纯度A260/280比值大于1.6,72.5％样品纯度比值在1.08～1.54之间;提取液DNA浓度:80％样品小于100μg/mL,20％样品在100～166μg/mL之间。微型琼脂糖凝胶电泳未观察到DNA条带。结论 用Chelex-100法有助于快速提取微量血痕中的DNA。     

Chelex-100法提取真核表达质粒pcDNA3-HERG的应用体会

目的探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒,将环状质性DNA酶切为线性,0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD(A260/A280)比较差异无统计学意义[分别为(1.8±0.6),(1.9±0.4),P0.05],经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA,Chelex-100法简便、省时,值得推广。     

白假丝酵母菌DNA提取方法的研究

目的建立一种提取白假丝酵母菌DNA的有效方法。方法采用蜗牛酶消化破壁形成原生质体,饱和酚/氯仿抽提法提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳及PCR反应等进行鉴定。结果提取物经琼脂糖凝胶电泳检测到DNA主带,基本无DNA碎带,提取的DNA浓度为(1.18±0.36)μg/μl,纯度好(OD260/OD280>1.7),不用RNase酶处理,无需任何纯化即可用于PCR扩增。结论本研究中提取DNA的方法简便易行,提取物可适用于各种分子生物学研究。     

磁珠法半自动提取全血基因组DNA条件的优化

目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案。方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响。结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P<0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80%时,DNA平均浓度最高。磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013)。当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μl时,OD260/OD280的比值较好。磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P<0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80%时,OD260/OD230的比值更好。结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80%的提取条件;而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得最优DNA提取效果。     

经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较

目的 比较经典酚/氯仿法和纯化试剂盒法抽提全血基因组DNA的差异.方法 分别对两种方法抽提的全血DNA产物进行紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳和体外聚合酶链锁反应（PCR）扩增.结果 两种方法DNA的提取效率相似,TaKaBa试剂盒法提取的纯度[光密度（OD）260nm/280nm]较常规酚/氯仿法明显提高.结论 TaKaBa试剂盒法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备.     

Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA

目的探索一种快速、高效提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA的方法。方法采用Chelex-100法提取14株革兰氏阳性杆菌的基因组DNA,利用PCR技术扩增16SrRNA基因及4个单拷贝管家基因以评价提取核酸的质量。结果 Chelex-100法能够在20min内从革兰氏阳性杆菌中提取出基因组DNA,所提取的DNA可直接用于PCR扩增。所有菌株的16SrRNA基因及棒状乳杆菌的4个单拷贝管家基因均扩增成功,PCR产物经电泳检测目的条带清晰特异,与预期目的片段长度相符。结论 Chelex-100法具有快速、高效、安全、经济的特点,采用这种方法提取的革兰氏阳性杆菌的基因组DNA可直接作为PCR扩增的模板。     

HBV C区基因克隆和PCR条件优化

目的 建立PCR优化条件和方法,探讨HBV C区基因在乙型肝炎PCR检测中的应用价值,为荧光定量PCR检测HBV摸索条件.方法 将HBV基因组导入DH5α大肠杆菌,SDS碱裂解法小量提取大肠杆菌阳性构建质粒DNA,设计合适引物对HBV C区基因进行PCR扩增,对PCR条件中的退火温度、Mg2＋浓度进行了优化,并比较三种不同Taq DNA聚合酶的灵敏度.结果 转化的大肠杆菌质粒DNA最佳退火温度为58℃,最佳Mg2＋浓度为1.5mM,同时确定天源公司的Biostar Taq DNA聚合酶灵敏度最高,扩增到10-6.结论 确立了HBV C区PCR的优化条件,将为后期进行荧光定量PCR检测HBV感染奠定基础以及为探索更有效的检测方法提供实验依据.     

改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的：设计并验证一改良的降落PCR(MTD—PCR)程序。方法：自盐藻bardawi1中提取基因组DNA作为PCR模板，使用TaqDNA聚合酶及pfu DNA聚合酶，运用普通PCR和MTD—PCR程序，扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列，并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果：使用普通Taq酶进行PCR，普通PCR程序产生200bp，500bp和1272bp的3条带，而MTD—PCR程序仅克隆出1272bp的特异带；利用高保真的pfu DNA聚合酶作PCR，在MTD—PCR泳道中也仅有1272bpl条带，而普通PCR除了产生1272bp的特异带外，还出现1条500bp的非特异带。结论：无论使用普通Taq酶或高保真酶pfu，改良的MT—PCR程序均明显提高PCR的特异性，提示它可用于克隆普通PCR难以克隆的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

PCR佐剂在单细胞PCR技术中的优化应用

目的:探索一种优化的单细胞PCR佐剂,应用于分子病理学研究中单细胞基因的检测。方法:从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中,应用激光捕获显微切割获取单个淋巴细胞,优化单细胞PCR反应体系进行actin基因检测。对照组不添加PCR佐剂,实验A、B、C组分别添加PCR佐剂二甲基亚砜、甘油、牛血清白蛋白。结果:对照组、实验A、B、C组的单细胞扩增阳性率分别为5%,7.5%,10%,45%,对照组和实验A、B组的单细胞扩增阳性率比较无显著性差异(P>0.05),而实验C组的单细胞扩增阳性率显著性高于对照组和实验A组(P<0.01)。结论:牛血清白蛋白是最佳的单细胞PCR佐剂,显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性。     

PCR基因芯片

基因芯片(gene chips)可以快速、微型化、自动化地检测大量基因,成了生物医学研究的重要推动力.随着微加工技术的发展, 我们建立了有1 200个微反应池的PCR基因芯片,将基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)技术结合在一起.PCR基因芯片综合了基因芯片体积小却可以检测大量基因,以及PCR敏感而且容易发现各种基因变异的特点,采用以PCR 为基础,而非以分子杂交为基础的检测方式,克服了杂交技术所存在的内在缺陷,大大增强了实验的敏感性和可重复性;扩展了基因芯片在生物医学领域中应用的范围,更适用于各种基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定.PCR反应采用荧光探针作实时定量分析.在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面会有广泛应用前景.     

用PCR结合甲基化特异PCR方法检测遗传性脆性X综合征

目的 建立一种快速、灵敏、廉价的实验室检测脆性X综合征(FXS)的方法.方法 检测130例样本的(CGG)n重复数.首先,PCR扩增脆性X智力低下基因Ⅰ(FMRⅠ)的(CGG)n重复序列;其次,进行甲基化特异性PCR (MS-PCR),对男性不能有效扩增和女性样本的基因组DNA进行亚硫酸氢钠脱氨基修饰,以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对(甲基化特异性引物对和非甲基化特异性引物对)扩增FMRⅠ基因的(CGG)n重复序列区,PCR产物测序.结果 所有样本的(CGG)n重复数都在13～47之间;测序结果表明FMRⅠ基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,甲基化的C碱基保持不变.结论 PCR结合MS-PCR方法可以同时检测FMRⅠ基因的 (CGG)n重复数和CpG岛的甲基化情况,为临床检测FXS提供了依据.     

博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化

目的 选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高.方法 通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基...     

Real-time PCR与常规PCR在Q热立克体检测中的比较

目的比较与评价Real-time PCR与常规PCR,寻求适合于Q热患者早期诊断的方法。方法应用Taq Man探针定量PCR、SYBR Green染料定量PCR、巢式PCR和普通PCR四种方法分别对T-A克隆的Q热立克次体基因htp AB片断进行灵敏性、特异性和重复性检测及评价。结果 Taq Man PCR方法的灵敏度分别为SYBR Green PCR、巢式PCR和普通PCR的10倍、10倍和100倍。重复性测试Taq Man法Ct变异系数CV:0.2%~3.0%,SYBR Green法的CV:0.3%~6.0%。Taq Man和SYBR Green PCR均耗时约1h,巢式PCR耗时约2.5h,普通PCR耗时约1.5h。四种方法检测25种相关病原菌结果均为阴性。结论 Taq Man探针定量PCR方法具有很好的特异性、灵敏性、重复性和可操作性,可用于Q热患者临床早期诊断。     

聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌

目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应（PCR）产物的微孔酶免疫方法,方法 对PCR所用2条引物进行双标记,使扩增产物一端标记上生物素,另一端标记上地高辛,通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定,然后用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体反应后显色测定。结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔板酶免疫法敏感性最强,加样量38nL时即可显色,模板DNA经过10^11倍稀释后仍为阳性结果,聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125uL,1.25uL及10^7,10^4稀释度,对临床脑脊液标本的检测结果微孔板酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%,二敏感性均高于琼脂微电泳,结论 建立的方法与常规电泳法相比灵敏准确,结果判断客观,重复性也较好;所测结果可相对反应PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法。     

PCR法与荧光定量PCR法在人巨细胞病毒检测中的作用比较

目的 比较常规PCR法与荧光定量RCR（RQ-PCR）法在人巨细胞病毒（HCMV）检测中的作用，寻找更适合于HCMV检测的方法。方法 构建携带CMV-DNA的标准质粒，利用常规PCR技术及FQ-PCR技术分别对不同稀释度的标准质粒进行检测。结果 FQ-PCR法对HCMV，标准质粒检测的灵敏度及线性范围均显著高于常规RCR法。结论 RCP法比常规PCR法更适合HCMV病毒的检测。     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法，对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测，阳性标本数53例，总阳性检测率58．24％；荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例，阳性检出率74．73％；两种方法联合，阳性标本数76例，阳性检出率83．52％。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率，也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。