人SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的细胞实验证实人清道夫受体B2(hSCARB2)是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型。方法构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠。通过Western Blot和免疫组化检测目的蛋白在各组织中的表达。EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的蛋白表达对病毒感染的促进效果。结果人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍。结论人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能。     

人肠道病毒71型亚单位疫苗的研制

目的利用原核表达技术制备人肠道病毒71型(EV71)的亚单位融合疫苗,并通过小鼠模型对其保护效果进行评价。方法在大肠杆菌中融合表达EV71的亚单位肽段,随后将肽段免疫雌鼠,对其交配后产下的幼鼠进行病毒感染,通过检测其组织内的病毒拷贝数和病理变化,对疫苗的保护效果进行评价。结果通过肽段融合的方法,得到五种备选疫苗,分别为VacA,VacB,VacC,VacD和VacE,这五种疫苗均具有一定的体外保护能力,并且VacB和VacC与正常人大脑组织无明显交叉反应。动物模型评价结果显示,VacB和VacE能赋予幼鼠抗病毒感染的保护效果。结论利用EV71的小鼠感染模型评价了针对EV71的亚单位联合疫苗,VacB和VacE的保护效果较好,此外,VacB与人脑组织间无明显交叉反应,可以作为潜在的无神经毒性的临床使用疫苗。     

人肠道病毒71型动物模型研究进展

人肠道病毒71型是婴幼儿手足口病的致病原之一,其严重的并发症可导致神经系统疾病,甚至死亡,是近期威胁中国儿童健康的因素之一.目前尚无临床疫苗可以预防该病毒感染,而EV71的动物模型是进行致病机理、疫苗评价和药物等研究的基础.本文对EV71的两种常用动物模型:小鼠和猕猴(Macaca mulatta)模型进行了描述,并对其在研究中的应用给与概括,为研究者选择合适的动物模型提供了依据.     

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的 人肠道病毒71型( EV71)感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症.建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础.方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10.使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测.结果 与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell,RD细胞)的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡.病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变.病理分析发现:感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一.结论 建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具.     

肠道病毒71型3CD蛋白对细胞的损伤作用

目的 研究肠道病毒71型(EV71)3CD蛋白在致病机制中的作用。方法 实验分为对照组、SDLY1组、SDLY107组和SDLY107(1-3CD)组。通过反向遗传技术将弱毒株SDLY1株的3CD蛋白编码区置换到强毒株SDLY107株,形成拯救病毒SDLY107(1-3CD)株。将EV71病毒接种于RD细胞和Vero细胞,于37℃和39.5℃孵育一定时间后,采用MTT试验检测活细胞量,以判断病毒对细胞损伤作用的改变。结果 37℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)对细胞的损伤作用弱于SDLY107株,但仍强于SDLY1株(P<0.05);39.5℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)株对细胞的损伤作用较SDLY107株下降(P<0.05),但与SDLY1株的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV713CD编码区的置换可以改变病毒对细胞的损伤作用,3CD蛋白编码区可能存在影响病毒毒力的位点。这一发现有助于理解EV71的致病机制。     

缺硒饲养ICR小鼠加快肠道病毒71型在体内的复制研究

目的观察硒蛋白对手足口病病原体肠道病毒71型（EV71）在感染动物体内复制的影响情况。方法将30只雌性ICR小鼠分为常规饲料组、缺硒饲料组和加硒饲料组,各种饲料饲养小鼠6周后,通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP—MS）测定小鼠外周血中硒的含量以及荧光定量PCR方法测定动物体内肠道病毒EV71的载量．然后用病毒空斑实验测定病毒滴度并用酶促法来测定主要硒蛋白酶的活性。结果通过测定外周血中硒的含量发现,缺硒饲料组的ICR小鼠硒含量为0．081μg／g,显著低于常规饲料组0．135μg／g和加硒饲料组的0．128μg／g,差异有统计学意义（P〈0．01）;用荧光定量PCR方法测定EV71载量,加硒饲料组ICR小鼠体内EV71核酸扩增Ct值,明显高于缺硒饲料组（P〈0．05）;ICR小鼠体内主要硒蛋白酶（GPX1）的活力在缺硒饲料组的动物体内显著低于加硒饲料组：病毒空斑实验结果表明,缺硒饲料组的ICR小鼠体内EV71病毒复制活力显著高于其他两组。结论缺硒可能导致硒蛋白GPX1合成减少或其活力降低从而加快EV71在宿主内的复制。     

肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。     

肠道病毒71型感染研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）属于小RNA病毒科（Picomaradae）肠道病毒属（Enterovirus）,同一属的病毒还有脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒等。这类病毒通过在人体的消化道组织中侵袭与繁殖,后经过血液循环传播,而最终导致多种临床病征。EV71最初于1969年由Schmidt等从美国加利福尼亚州1名9个月大的脑炎患儿的脑脊液中分离出,1972年定出血清型,并于1974年首次报道。其后,在全世界发现各种各样的临床表现和很多致命性感染与EV71相关。     

抗肠道病毒71型外壳蛋白1卵黄抗体的制备和鉴定

目的 克隆肠道病毒71型（EV71）BrCr株外壳蛋白1（VP1）基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白（IgY）.方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21（DE3）,获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1：104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.     

肠道病毒感染致神经损伤小鼠脑组织NOD样受体蛋白3的表达

目的:探讨NOD样受体蛋白3(NLRP3)在肠道病毒(EV)感染导致的神经损伤中的作用.方法:30只BALB/c小鼠分为对照组、肠道病毒(EV)71组和柯萨奇病毒A组2型(CVA2)组,每组10只.EV71组和CVA2组小鼠分别经腹腔注射EV71或经肌内注射CVA2,观察临床症状和生存情况.感染后第7天,采用HE和尼氏...     

肠道病毒71型感染治疗方法研究进展

肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）是引起重症手足口病的主要病原体。随着其病毒特征、感染和发病机制逐渐清晰,EV71感染的治疗策略也逐步明确。一方面是直接靶向EV71感染过程,针对具体靶点进行EV71感染或发病过程的干预;另一方面是通过调节宿主免疫清除病毒、缓解炎症、保护未感染细胞。目前已经在临床应用的治疗药物不多,大多尚处于临床前研究阶段。也有干扰素类具有广谱抗病毒和免疫调节双重作用的细胞因子在临床使用,或者通过药物联用的方法增强抗病毒效果,降低毒性和耐药性。本文对近年来报道的不同类型的EV71治疗药物进行综述,以期为深入研究抗EV71感染的治疗策略提供帮助。     

瑞德西韦对感染肠道病毒71型的人横纹肌瘤细胞和 ICR乳鼠的抗病毒活性

探讨瑞德西韦（RDV）在细胞与动物水平对肠道病毒71型（EV71）的抗病毒活性,并阐明其抗病毒作用机制。     

荆门地区肠道病毒EV71型感染的流行病学调查

目的探讨肠道病毒EV71型在湖北荆门地区手足口病流行病学中的重要意义。方法收集2008年荆门地区手足口病临床诊断病例682份,对该病发生地区、时间、人群分布进行统计;分离102份血清、粪便、咽拭子及疱疹液标本的病毒并运用RT-PCR扩增技术对其病原学进行检测。结果该市2008年手足口病城区发病率为113.55/l0万,农村发病率为49.26/10万,城区发病显著高于农村（P〈0.01）;流行季节以春季及初夏为主;病原学检查主要为EV71;2-3岁年龄段多发。结论手足口病流行具有明显的地域、时间、年龄等特点;EV71病毒是手足口病实验室诊断病例的主要病原。     

人肠道病毒71型感染致重症手足口病的危险因素分析

目的 探讨肠道病毒71型感染导致重症手足口病的危险因素。方法 选取2015年5月至2017年10月间我院感染科收治的EV71型手足口病患儿140例为研究对象,依据临床分期标准分为普通病例组95例和重症病例组45例,收集并比较两组患儿一般资料、临床表现、实验室指标等,采用多因素Logistics回归分析判断影响手足口病重症化的危险因素。结果 两组患儿的性别、年龄、BMI间比较差异无统计学意义（P>0.05）;两组患儿的ALT、AST、脑脊液葡萄糖浓度比较差异无统计学意义（P>0.05）,但重症病例组的WBC [（12.65±3.51）×10⁹/L vs （9.16±3.44）×10⁹/L]、CRP[（10.67±4.75）mg/L vs（6.58±3.04） mg/L]、热程[（7.46±2.21）d vs（2.93±1.22）d]、热峰[（38.91±0.35） ℃ vs（38.34±0.45） ℃]、血糖[（8.40±0.78） mmol/L vs（5.96±1.14） mmol/L]、CK-MB[（17.84±1.57）U/L vs（15.75±1.64）U/L]、NP[53.47（31.50~70.22）% vs 46.89（29.44~67.01）%]、肢体抖动（37.78% vs 9.47%）、脑脊液蛋白质浓度[319.63（211.40~463.53）mg/L vs 224.82（172.24~396.91）mg/L]、脑脊液细胞数[（18.74±5.62）×10⁶/L vs （4.87±2.03）×10⁶/L]均较普通病例组显著升高,脑脊液氯化物水平[（117.52±2.84）mmol/L vs （119.75±3.09）mmol/L]较普通病例组显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）;多因素Logistics回归分析发现,热程延长（OR=8.812）、热峰升高（OR=682.359）、血清CRP（OR=1.920）、CK-MB水平升高（OR=6.299）以及脑脊液蛋白质浓度升高（OR=1.014）是手足口病重症化的独立危险因素（P<0.05）。结论 EV71感染手足口病重症化与患儿年龄、性别无关,与热程、热峰、CRP、CK-MB、脑脊液蛋白质浓度呈正相关,可作为判断EV71感染手足口病重症化的独立危险因素。     

白藜芦醇体外抗肠道病毒71型的作用

目的在体外观察白藜芦醇抗肠道病毒71的作用效果。方法将白藜芦醇作用于Vero细胞,CCK-8法检测其细胞毒性。以利巴韦林作为对照药物,分别在病毒感染细胞的不同阶段加入白藜芦醇,观察细胞病变(CPE),CCK-8法检测并计算病毒抑制率、半数有效浓度(IC50)及选择指数(SI),评价白藜芦醇的抗病毒效果。结果低浓度的白藜芦醇对细胞是无毒性的,细胞半数毒性浓度(TC50)为307.6 mmol/L。白藜芦醇只在预处理细胞后具备抗病毒效果,药物半数有效浓度(IC50)为20.2 mmol/L,白藜芦醇抗EV71的选择指数(SI)为15.2。而在病毒吸附细胞后,以及白藜芦醇直接与病毒液混合,均无抗病毒作用。结论白藜芦醇具有一定的抗肠道病毒71的作用。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

EV71动物模型及其在疫苗研究中的应用

人肠道病毒71型(EV71)是引起手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一,主要引起5岁以下婴幼儿手-足-口部疱疹,一般症状轻,但少数患儿出现无菌性脑膜炎、脑干脑炎等多种重症中枢神经症状,病程进展迅速,病死率     

夫西地酸钠抗肠道病毒EV-A71的活性分析

目的 分析夫西地酸钠在细胞水平上的抗肠道病毒活性并分析其抗EV-A71的作用机制。方法 通过空斑分析测定夫西地酸钠在RD细胞中抗EV-A71和CV-A16的量-效曲线;通过加入时间分析（time of addition）、病毒吸附及内吞实验、反转录-定量PCR（RT-qPCR）测定病毒RNA水平在复制周期中的变化、携带GFP的病毒RNA（EV-A71-GFP RNA）转染合并荧光观察以及双报告基因分析初步确定夫西地酸钠阻断EV-A71复制的作用机制。结果 夫西地酸钠可以显著抑制EV-A71和CV-A16在RD细胞中的复制,MOI为0.001时IC₅₀ 分别为3.56 μmol/L和5.41 μmol/L。夫西地酸钠抑制EV-A71复制主要发生在复制早期阶段,降低了病毒RNA的丰度和病毒蛋白的合成水平,但不影响病毒的吸附和内吞;与未经药物处理的对照组相比,EV-A71感染5 h和8 h时,夫西地酸钠导致EV-A71 RNA相对丰度降低了大约70%;EV-A71-GFP RNA在292A细胞中的翻译明显受到夫西地酸钠的抑制,GFP阳性细胞明显减少;夫西地酸钠对EV-A71 5′-UTR所驱动的报告基因翻译抑制程度为30%。结论 夫西地钠酸具有抗肠道病毒活性,主要通过直接或间接抑制病毒基因组RNA复制以及干扰病毒蛋白合成或加工而发挥抗EV-A71活性。