恶性胶质瘤细胞诱导内皮细胞三维成型的体外实验

目的观察在三维胶原体外培养条件下恶性胶质瘤细胞体外诱导内皮细胞血管生成的作用.方法采用鼠尾胶原作为内皮细胞样细胞ECV-304培养的支架,以恶性胶质瘤细胞系SHG-44作为诱导条件,观测ECV-304细胞生长和小管样结构形成的过程,测定形成曲线、小管管径和管长以及细胞周期,比较有和无SHG-44细胞诱导ECV-304细胞形成小管样结构的差异.结果 SHG-44细胞对体外三维培养的ECV-304细胞具有诱导小管形成的作用,所诱导的小管管径和管长数值均较对照组大,小管形成时间早.结论恶性胶质瘤细胞能促进内皮细胞的生长、迁移和小管结构的形成,是研究体外血管生成研究的良好模型.     

人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养及鉴定

目的:建立人非小细胞肺癌血管内皮细胞体外分离培养体系,研究其体外生长特性。方法:利用酶消化法分离出肺癌组织微血管片段,采用植块培养法培养原代内皮细胞,先后以局部消化法和差速黏附法进行纯化;应用光镜、免疫细胞化学及免疫荧光技术对所获得的人肺癌血管内皮细胞进行鉴定。结果:所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞呈FⅧ-RAg、CD34阳性;电镜下生长状态良好、可传代培养。结论:本研究摸索并建立了人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养方法,所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞对肿瘤血管生成及抗肿瘤药物的研究具有重要价值。     

裸小鼠可移植人脑胶质瘤中VEGF、vWF的表达和血管形成关系的初步研究

目的　探讨血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、温韦伯因子 (vWF)在裸小鼠可移植人脑胶质瘤不同生长阶段的表达规律以及对血管形成的作用。方法　建立移植瘤动物模型 ;用组化及免疫组化的方法处理 30例移植瘤、6例对照组移植瘤和 6例正常脑组织石蜡标本 ;统计分析病理指数、微血管密度、坏死指数和瘤重等指标。结果　移植瘤中VEGF的表达阳性率为 10 0 % ,与坏死指数和微血管密度呈显著正相关 (r为 0 .5 2 4、0 .4 96 ,P <0 .0 1) ,与瘤重不相关。结论　VEGF在移植性人脑胶质瘤的血管形成及肿瘤的发展、侵袭和转移中具有重要作用。VEGF和微血管密度可作为胶质瘤恶性生物学行为的指标之一。     

人脑胶质瘤中DLL4表达与血管生成的关系

目的:分析Notch信号配体——Delta样配体4(DLL4)在人脑胶质瘤中表达及其与肿瘤恶性程度、微血管密度(MVD)之间的关系,探讨DLL4在肿瘤血管生成中的作用,及DLL4作为抗肿瘤治疗靶点的可能性。方法:免疫组织化学方法检测36例人脑胶质瘤及7例正常脑组织中DLL4和血管内皮生长因子(VEGF)表达情况,用CD31标记血管内皮细胞以计算MVD。结果:DLL4及VEGF表达水平在正常脑组织、高度恶性和低度恶性胶质瘤组两两之间均有差异(P<0.01),其表达随胶质瘤恶性程度升高而增强(P<0.01);DLL4和VEGF表达之间呈正相关(r=0.539,P<0.01),两者均与MVD相关。结论:DLL4在胶质瘤的血管生成中发挥重要作用,有望成为肿瘤抗血管生成治疗的靶点。     

人卵巢癌微血管内皮细胞的培养及体外管腔样结构形成的观察

目的建立人卵巢癌微血管内皮细胞(ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells,ODMECs)免疫磁珠分选体系并观察ODMECs体外二维管腔样结构(tubule-like structure,TLS)的形成。方法利用结合有CD31抗体的MACS MicroBeads免疫磁珠分选系统分离纯化ODMECs。通过形态学、生化和表型特征对所获得的ODMECs进行鉴定;并检测其摄取乙酰化低密度脂蛋白(acetylated-low-density lipoprotein,DIL-acLDL)和结合凝集素Ⅰ(UEA-Ⅰ)的能力,观察其在体外培养体系中二维管腔样结构的形成。结果所获ODMECs流式分析细胞纯度可达99.6%,具有卵石征、接触抑制,表达CD31、CD105、FⅧ-Rag;具有结合UEA-Ⅰ和摄取DIL-acLDL的能力;培养过程中观测到ODMECs可形成二维管腔样结构。结论成功建立了人ODMECs的免疫磁珠分离培养方法,并观察到ODMECs具有体外二维管腔样结构。     

人原发性肝癌血管内皮细胞的分离培养及鉴定

目的建立人原发性肝癌血管内皮细胞体外分离培养体系并研究其体外特性.方法利用酶消化法分离出肝癌组织微血管片段,采用植块培养法培养原代内皮细胞,依次以局部消化法和差速黏附法进行纯化;应用光镜、透射电镜和免疫细胞化学等技术对所获得的人原发性肝癌血管内皮细胞进行鉴定.结果所获人肝癌血管内皮细胞呈FⅧ-RAg阳性;CD34,CD105阳性;电镜下可见Weibel-Palade小体;生长状态良好、可传代培养.结论本研究摸索并建立了人肝癌血管内皮细胞的分离培养方法,所获人肝癌血管内皮细胞对肿瘤血管生成及抗肿瘤药物的研究具有重要价值.     

人脑星形胶质细胞瘤血管内皮生长因子表达、血管生成及细胞增殖活性的研究

目的 研究血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)在星形细胞瘤中的表达,探讨VEGF与肿瘤血管生成和细胞增殖的关系.方法 SP免疫组化法对64例星形细胞瘤的VEGF和PCNA表达进行观察.CD31单克隆抗体免疫组化染色显示微血管,用微血管计数(MVC)测定肿瘤血管生成.结果 VEGF蛋白主要分布在高级别胶质瘤组织的瘤细胞和内皮细胞,低级别胶质瘤呈低表达,且与PCNA的表达成显著正相关(r=0.991,P＜0.01);高级别胶质瘤MVC显著高于低级别胶质瘤.结论 VEGF可能参与胶质瘤血管生成,对胶质瘤的恶性进展起促进作用,PCNA较能客观地反映肿瘤的恶性程度.     

诺帝对体外内皮细胞三维成型的抑制作用

目的 观察自行研制的抗肿瘤制剂诺帝(Nordy)对三维胶原体外培养条件下恶性胶质瘤细胞诱导ECV304细胞血管生成的抑制作用.方法 采用不同浓度、不同时相点给药;观测在恶性胶质瘤细胞系SHG-44诱导 ECV304细胞生长和小管样结构形成的过程中,ECV304细胞增殖周期、凋亡率以及小管样结构形成数目、大小等指标.比较诺帝对SHG-44细胞诱导ECV304细胞形成小管样结构作用的差异.结果 诺帝对SHG-44细胞诱导的体外三维培养ECV304细胞小管形成具有明显的抑制作用,主要表现在细胞增殖周期、凋亡率以及小管样结构形成数目、大小等指标都有不同程度的改变.结论 诺帝通过对细胞核增殖的抑制和诱导部分凋亡作用来抑制小管结构的形成,是一种具有抗体外血管生成作用的良好制剂.     

内皮祖细胞的分离培养及生物学特性的鉴定

目的 探讨大鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPC)体外诱导、培养和扩增的方法.方法 梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,分为血管内皮生长因子(VEGF)诱导组和非诱导组进行体外培养,应用免疫细胞化学和流式细胞术分别进行鉴定.结果 大鼠骨髓单个核细胞(MNC)经过培养,形成线样结构和类血管样结构,表达EPC特异性抗原CD133和内皮细胞(EC)的特异性抗原Ⅷ因子、Flk-1、和CD34,培养细胞同时具有EPC和EC的表面蛋白特性,且诱导组阳性细胞数多于非诱导组,形成特殊结构的时间早于非诱导组.结论 ①通过分离骨髓MNC进行诱导培养可以提高EPC的纯度.②VEGF可促进EPC的增殖和血管样结构的形成.③体外培养1周左右是EPC增殖的高峰期.     

不同细胞密度对小鼠心肌微血管内皮细胞小管生成的影响

目的 探讨小鼠心肌微血管内皮细胞的体外小管生成实验的最佳细胞浓度，从而为心脏微血管的研究提供体外实验模型。方法 组织块贴壁法培养小鼠心肌微血管内皮细胞，将小鼠心肌微血管内皮细胞分成5×103个/孔、1×104个/孔、2×104个/孔、3×104个/孔4组，并接种至Matrigel胶包被的48孔板中，细胞接种后24 h在倒置显微镜下观察拍照，并用Image J软件对形成的管腔数量、分支数量进行统计，统计结果用（x-〗±s)表示，数据采用SPSS 17.0软件分析。结果 组织块贴壁法可成功培养小鼠心肌微血管内皮细胞，分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞vWF相关抗原阳性表达。细胞密度为5×103个/孔时无管腔样结构生成，当细胞浓度为1×104个/孔、2×104个/孔、3×104个/孔时可有管腔样结构生成。细胞浓度为2×104个/孔时形成的管腔数量及分支数量高于1×104个/孔、3×104个/孔（P＜0.05）。 结论 分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞具有血管形成能力。在一定的细胞接种浓度范围内，接种的细胞密度越大，体外血管形成能力增强，但细胞浓度超过血管形成的最佳浓度后，随着接种细胞浓度的增大，小鼠心肌微血管内皮细胞的体外血管形成能力减弱。     

银屑病患者皮损中细胞衰老、增殖和凋亡检测

目的：探讨银屑病患者皮损中细胞增殖、衰老和凋亡的变化。方法：应用组织化学、免疫组织化学和末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）介导的d-UTP－生物素缺口末端标记（TUNEL）等技术原位检测了20例银屑病患者（试验组）皮损和10例正常人（对照组）皮肤细胞中与衰老细胞相关的β－半乳糖苷酶（SA－β－Gal)、增殖细胞核抗原（PCNA）和凋亡细胞。结果：银屑病皮损中衰老细胞、增殖细胞和凋亡细胞数均比正常人皮肤增多，试验组与对照组阳性率分别为55％／10％、80％／30％、70％／20％，经χ^2检验，P＜0．05，差异有统计学意义。结论：衰老细胞与凋亡细胞的增加共同对银屑病增殖代谢加快起到部分代偿作用。     

一种新的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离纯化及培养方法的探讨

目的:建立一种简捷的分离纯化培养子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的方法。方法:选择子宫全切育龄妇女的新鲜子宫内膜组织,经单酶消化、二次筛网过滤及贴壁纯化技术分离纯化培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,光镜及免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:腺上皮细胞漩涡状生长,细胞呈蝌蚪形或类圆型,细胞角蛋白19免疫组化染色阳性,纯度可达92%。基质细胞呈平行状生长,细胞呈梭形或多角形。波形蛋白免疫组化染色阳性,纯度达95%以上。每例子宫肌瘤切除标本可获得(10～25)×106原代基质细胞和(4～6)×106原代腺上皮细胞。结论:该培养方法可获得高产量的纯化的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

Serrin B和Nodosin对HL60、SGC7901、LOVO、U87、AGZY细胞株的毒性作用

目的探讨天然药物Serrin B和Nodosin对人早幼粒白血病细胞株HL60、人胃腺癌细胞株SGC7901、人结肠癌细胞株LOVO、人胶质瘤细胞株U87、人肺腺癌细胞株AGZY的毒性作用。方法将对数期生长的HL60、SGC7901、LOVO、U87、AGZY细胞株接种于96孔板中,细胞贴壁后,分别加入Serrin B或Nodosin,使药物的终浓度分别为0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μmol.L-1,24 h后用四甲基偶氮唑盐法检测细胞株的死亡率。结果 Serrin B对HL60、SGC7901、LOVO、U87和AGZY细胞株均有较强的毒性作用(P<0.01),且其毒性作用呈现剂量-效应关系。Nodosin对HL60、SGC7901、LOVO、U87细胞株具有较强的毒性作用(P<0.05,P<0.01),而对AGZY细胞株无明显毒性作用。结论 Serrin B和Nodosin是中药溪黄草抗癌作用的有效成分,为人类多种肿瘤治疗的新药研究开发提供新的思路。     

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法,并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液,随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞,细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出,纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织,活力为92.1%±2.1%,纯度为96.5%±2.2%;原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织,活力为90.1%±3.8%,纯度为93.1%±1.5%;原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织,活力为96.2%±2.7%,纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A,逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖,至14 d时仍表达CD68,具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法,为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。     

树突状细胞黏附、趋化及迁移的分子机制

 树突状细胞是体内功能最强的抗原递呈细胞，细胞移行是其接受抗原刺激、激发T细胞免疫反应的基础，两者之间相互协调影响。从血液中的前体细胞到次级淋巴器官中成熟细胞的转化的过程中，趋化因子及其受体、黏附分子及基质金属蛋白酶的共同作用使树突状细胞得以精确迁移，发挥抗原递呈作用。     

丁酸对人肺癌细胞的生长,细胞周期和形态的影响

运用鉴别细胞群体生物学特性的常规方法和流式细胞光度术(FCM),我们研究了正了酸对人肺癌细胞(PLA-801D)的某些生物学作用。当培养液中含2或3mmol/L丁酸时,细胞分裂和增生受到明显抑制,群体倍增时间几乎延长1倍,细胞周期行进受阻,大多数细胞阻断在G1期,平皿集落形成率从23.9％降为1.9％,饱和密度从237.4万/ml降至48.8万/ml,细胞群体提前3d进入饱和状态。与此同时,细胞变扁平,几乎丧失叠堆生长能力,表面膜活动减弱,核形趋于规则,染色质颗粒分散变稀疏,细胞间粘着连接明显增多。以上发现提示丁酸可使PLA-801D肺癌细胞获得一些相对正常的生长特性和表型,显示丁酸对该细胞有一定程度的分化诱导作用和潜在的抗癌作用。     

人骨形态发生蛋白2，3，6，12对大鼠骨肉瘤 细胞株UMR106的作用

目的：研究人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic proteins, hBMP）对大鼠骨肉瘤细胞株UMR106的作用。方法：用hBMP2,3,6,12重组腺病毒（AdBMP2,3,6,12）干预大鼠骨肉瘤细胞株UMR106,利用台盼蓝拒染法、TUNEL法、吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光双染法、Transwell小室和碱性磷酸酶活性测定法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移以及成骨分化能力的变化。结果：与空白对照组和实验对照组比较,AdBMPs的干预致骨肉瘤细胞株细胞存活率降低,并呈一定的时间依赖性;凋亡率均随时间延长而增加,并且TUNEL和 AO/EB两种检测方法的结果一致;3个检测时间点的细胞穿膜数均明显减低;碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性在干预第3天开始逐渐增加,至第9天仍可观测到,以上差异均有统计学意义(P＜0.01)。结论：以腺病毒介导基因转入的作用方式,hBMP2,3,6,12可以抑制大鼠骨肉瘤细胞株UMR106的增殖和迁移,并诱导其凋亡和向成骨细胞分化。     

沉默CCL19对结直肠癌增殖、迁移、侵袭和促血管形成的影响

目的研究趋化因子CCL19在结直肠肿瘤中的作用。方法采用Real—TimePCR和Westernblotting技术筛选高表达CCL19的细胞株SW620细胞作为研究对象,并用siRNA沉默SW620中的CCL19基因。分别采用细胞增殖实验、Transwell迁移、侵袭实验和小管形成实验来检测SW620细胞的增殖、迁移、侵袭和促血管形成能力的变化。结果Westernblotting和Real—TimePCR证实SW620中CCL19相对其他细胞株高表达。经siRNA-CCL19干扰后,SW620细胞在48～120h内细胞增殖能力显著上升（P〈0．05）,细胞迁移、侵袭能力亦明显上升（P〈0．05）,促血管形成能力明显增强。结论SW620是相对高表达CCL19的细胞株,沉默CCL19基因后可以明显促进SW620细胞在体外的增殖、迁移、侵袭和促血管形成能力,因此认为CCL19在结直肠癌发展中起着抑制作用,并有应用于抗癌药物研究的前景。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法:取成年雄性Wistar大鼠,用链蛋白酶、胶原酶体内门静脉灌注消化大鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:肝星状细胞得率为2.8×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。Desmin阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。结论:改良大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。