视网膜色素上皮细胞培养及移植进展

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的代谢障碍与许多眼底疾病的发病有着密切的关系。将体外分离、培养的视网膜色素上皮细胞移植入患眼治疗眼底疾病是当今眼科研究的热点之一。现将目前有关于RPE细胞体外分离、培养及移植的研究进展进行综述。     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养

目的：将猪视网膜色素上皮(RPE)细胞进行体外培养，为研究RPE细胞的功能及治疗有关眼底疾病提供细胞来源。方法：采用胰酶2次消化法分离猪RPE细胞，15％DMEM培养液培养，每天倒置显微镜观察细胞生长情况，并作流式细胞仪分析培养细胞的细胞周期。以免疫组织化学法鉴定培养细胞的来源。结果：离体培养细胞初期呈圆形，富含黑色素，12～24h贴壁呈圆形、梭形及不规则形。传代后细胞渐趋透明。免疫组化证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。细胞周期分析提示体外培养的RPE细胞保持正常的繁殖能力。结论：培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源。     

四种气管上皮细胞分离培养方法的比较研究

目的：比较四种不同的方法在培养气管上皮细胞中的异同，改进其培养技术，为组织工程气管提供种子细胞。方法：用两步酶消化法（使用0.1％ Dispase 4℃消化18h后，用0．25％的胰酶37℃消化5min）、Dispase冷消化法（用0．1％Dispase 4℃消化18h）、胰酶温消化法（0．25％的胰酶37℃消化10min）和机械刮刷法四种方法分离、培养兔气管上皮细胞，测定分离细胞的数量和纯度。结果：两步酶消化法、Dispase冷消化法较其他两种方法得到的气管上皮细胞纯度高，细胞状态好；Dispase冷消化法得到细胞数量较其他方法少，其余三种方法得到的细胞数统计学上不存在差异。结论：两步酶消化法较其他方法所得细胞数量多、纯度高、细胞成活率高，是一种较好的气管上皮细胞体外分离培养方法。     

维拉帕米抑制原代培养兔视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究

为评价维拉帕米(verapamil)对兔视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增殖的影响,在原代培养的兔RPE中分别加人不同浓度的维拉帕米溶液(0.1μmol/L,1 μmol/L,1×101μmol/L,1×102μmol/I,1 ×103μmol/L,1×104μmol/L),于培养72 h后用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,在酶联免疫测定仪上测630 nm处吸光值,同对照组相比,计算出不同药物浓度条件下的抑制率.结果表明维拉帕米在0.1μmol/L浓度以上对RPE的增殖有抑制作用;在10 μmol/L浓度时使RPE增殖率显著下降.提示维拉帕米作为钙通道拮抗剂对RPE的增殖有抑制作用,可作为今后临床上防治增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的药物进行研究.     

舒拉明对培养的人视网膜色素上皮细胞移行的影响

目的 观察舒拉明（suramin)对培养的人视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium,RPE)移行的影响。方法 在体外培养的RPE细胞的损伤模型中,加入不同浓度的舒拉明（1.5,15,150mg/L)观察12h,24h和48h3个时间点RPE细胞移行率。结果 无血清培养液中的RPE细胞有较弱的移行能力,含有100ml/L新生小牛血清的培养液可以显著刺激RPE细胞移行（P＜0．01）,3种浓度舒拉明可以显著抑制100ml/L血清条件下的RPE细胞的移行,12h移行率分别对照组的82％、74％和46％、24h为92％,83％和52％、48h为92％,84％和55％这种作用呈剂量依赖性。结论 血清中的某些成分可以刺激RPE细胞的移行,舒拉明可以抑制血清的这种作用,为临床预防和治疗增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR)提供了新的用药思路。     

兔晶体上皮细胞培养技术的改进

研究兔晶体上皮细胞的培养并对组织块培养法作了改良。在原代培养中，用吸管转移晶体囊膜较为简便易行。可为各种实验提供原代或传代的兔晶体上皮细胞。     

兔视网膜色素上皮细胞的体外培养及超微结构研究

目的：将兔视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞进行体外培养,观察其超微结构。方法：用胰酶消化法培养兔ＲＰＥ细胞并传代。扫描电镜和透射电镜观察其超微结构。结果：原代培养的ＲＰＥ细胞含大量色素呈多角形,传代的细胞透明呈梭形。电镜显示它们具有细胞极性,含黑色素颗粒、各种细胞器、细胞间连接复合体,与体内一致。结论：培养的大量细胞可用于ＲＰＥ的体外实验研究。     

人视网膜色素上皮细胞的培养

目的 :培养人视网膜色素上皮细胞 ,为采用视网膜色素上皮移植治疗色素变性奠定基础。方法 :用胰酶消化法获取人胎儿视网膜色素上皮细胞进行原代及传代培养。角蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果 :视网膜色素上皮细胞在体外生长良好 ,胞浆内含有丰富的色素颗粒。抗角蛋白反应阳性。结论 :体外培养视网膜色素上皮细胞成功为细胞移植提供了一个良好的来源     

兔视网膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的 用改良的二步酶法制备视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液，不做玻璃体切割，直接进行视网膜下间隙的移植。方法 用酶I（含220kU/L)透明质酸酶和0.1%胰蛋白酶）分离视网膜神经上皮层与RPE之间的联系，再用酶Ⅱ（含0.25%胰蛋白酶）将RPE从玻璃膜上分离下来获得悬浮的RPE细胞，用特制的移植针头通过人为造成的局限性视网膜脱离区将其移植入受体视网膜下间隙。结果 术后2周供体RPE细胞呈单层排列于受体视网膜下间隙并存活，未见明显炎症反应。电镜观察术后5周供体RPE细胞位于受体Bruch膜上并与受体感光细胞外节盘膜形成镶嵌关系。结论 改良的内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间膜，并至少存活7周。     

TCP液在兔眼虹膜色素上皮细胞培养中的应用

目的寻求一种更好的培养兔眼虹膜色素上皮细胞的方法。方法采用TCP液和胰酶消化与培养IPE细胞,对比消化后的细胞形态及贴壁率。结果TCP液消化获取IPE细胞分散均匀,细胞呈圆形,胞质内充满棕黑色颗粒,几乎见不到细胞核,贴壁率为83.6%±2.3%。胰酶消化细胞多呈现絮状、团块及集落样,单个细胞散在,数量较低细胞贴壁率为67.7%±3.5%。结论TCP液对于消化获取IPE细胞较胰酶有更好的效果。     

肾上腺素诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究

目的　观察肾上腺素对体外培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞凋亡的影响 ,探讨细胞凋亡与中心性浆液性脉络膜视网膜病变的关系。方法　通过流式细胞技术 (FCM )、光镜、TUNEL细胞凋亡原位末端标记法检测肾上腺素和 β 受体阻滞剂普萘洛尔对体外培养的人RPE细胞凋亡的作用。 结果　人RPE细胞对低浓度的肾上腺素有一定耐受作用 ,10 pg/ml～ 10 4pg/ml肾上腺素组无明显凋亡的发生 ;10 5pg/ml～ 10 8pg/ml肾上腺素诱导RPE细胞 72h可以检测到凋亡峰 ,与对照组比较有显著性差异 (P <0 0 1) ;加入 10 3 pg/ml普萘洛尔可以提高RPE细胞对肾上腺素毒性作用的耐受 ,未检见RPE细胞凋亡的发生。TUNEL法光镜下观察到细胞核被蓝色染料标记的凋亡细胞。结论　肾上腺素可以诱导培养的人RPE细胞凋亡 ,这可能是中心性浆液性脉络膜视网膜病变早期病理改变的机制之一。     

bFGF对体外培养牛视网膜色素上皮细胞激光损伤的实验研究

目的:观察激光损伤后不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对RPE细胞修复的作用。方法:采用甲基噻唑基四唑(Methylthiazolyte-trazolium,MTT)方法测定100mW功率的激光损伤后分别应用6种浓度的bFGF,不同时间RPE细胞的损伤修复情况。结果:激光照射后应用bFGF24小时可明显增加RPE细胞的再生,并呈剂量相关。结论:激光照射后应用bFGF对RPE细胞修复有促进作用。     

兔视网膜色素上皮细胞移植术后急性排斥反应的病理学研究

目的：研究视网膜色素上皮细胞移植后排斥反应的发生及其控制过程。方法：以经巩膜外路移植方法行家兔同种异体视网膜色素上皮细胞移植,应用光镜及电镜观察移植后１４ｄ受体视网膜及移植细胞的病理学改变和免疫抑制剂对其影响。结果：单纯移植组移植排斥反应变化明显;免疫抑制剂组无排斥反应的变化。结论：家兔同种异体间视网膜色素上皮细胞移植有急性排斥反应的发生,但在控制排斥反应的情况下,移植细胞可保持原有形态     

金雀异黄素对氯化钴诱导的兔视网膜色素上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的：研究氯化钴对体外培养的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞血管内皮生长因子(vEGF)表达的诱导作用，以及金雀异黄素(genistein，Gen)对其表达的影响。方法：采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜，以荧光比值来表示VEGF的表达，半定量分析氯化钴处理不同时间对体外培养的BPE细胞VEGF蛋白表达的诱导作用，以及Gen对低氧或氯化钴诱导的VEGF表达的影响。结果：对照组有低水平VEGF蛋白的表达，随着低氧或氯化钴处理时间的延长，荧光比值的变化表现为时间依赖性，在6h点达到高峰。Gen(50、100、200μmol/L组)与二甲基亚砜(DMSO)对照组相比，均可明显抑制氯化钴诱导的VEGF的表达，且此种抑制作用呈浓度依赖性。结论：Gen可抑制氯化钴诱导的RPE细胞VEGF表达，提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值。     

光动力疗法对血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞的影响

[目的]研究光动力疗法(PDT)在体外对视网膜色素上皮细胞和血管内皮细胞的影响.[方法]将体外培养的视网膜色素上皮(RPE)细胞和血管内皮细胞与PDT治疗年龄相关性黄斑变性时血药浓度(1.0 μ/mL)相当的光敏剂verteporfin共同孵育,根据孵育时间的不同,每种细胞分成7组,即0 min组、5 min组、15min组、30 min组、60 min组、120 min组和对照组,孵育至上述时间后,分别用光敏剂最大吸收波长的光照(689 nm、功率密度为600 mW/cm2的二极管激光),能量密度为2.4 J/cm2,用MTT法检测24 h后各处理组细胞的存活率.所有实验数据均以均数±标准差的形式表述,数值为3次独立重复实验的平均值,资料统计采用方差分析和t检验.[结果]PDT后24 h,RPE细胞在0 min组、5 min组、15 min组、30 min组、60 min组和120 min组的细胞平均存活率分别为:0.94±0.07、0.68±0.13、0.68±0.11、0.65±0.12、0.49±0.11和0.21±0.11,细胞的存活率随与光敏剂孵育时间的延长而下降,经单因素方差分析,不同时间组的细胞存活率有显著性差异(P=0.000),SNK-q检验,5 min组、15 min组、30 min组、60 min组、120 min组与0 min组比较都有统计学差异;血管内皮细胞在上述各时间组的平均存活率分别为:1.02±0.05、0.78±0.08、0.71±0.11、0.69±0.08、0.62±0.09和0.23±0.11,细胞的存活率随孵育时间的延长而下降,经单因素方差分析,不同时间组的细胞存活率有显著性差异(P=0.000),SNK-q检验,5 min、15 min、30 min、60 min、120 min组与0 min组比较都有统计学差异;PDT后两种细胞在相同时间组的细胞存活率经t检验均无统计学差异(所有P>0.05).[结论]PDT在体外对RPE细胞和血管内皮细胞均有快速地杀伤作用,两种细胞对PDT有相似的敏感性.提示临床上与脉络膜新生血管密切相关的RPE细胞可能受到PDT的损害,提出早期脉络膜新生血管进行PDT治疗可能减少对邻近的RPE细胞或神经细胞的损害.     

异体恒河猴视网膜色素上皮细胞移植探讨

目的 观察供体视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)在视网膜下腔生长情况,为视网膜色素上皮细胞移植的临床应用提供实验基础.方法 体外获取恒河猴视网膜色素上皮细胞经传代培养至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶标记后经外路将供体色素上皮细胞移植到受体恒河猴视网膜下腔,用光镜和电镜观察移植细胞的存活情况.结果 供体细胞在受体视网膜下腔形成有极性的单细胞层,贴附于Brueh膜上,并形成微绒毛和基底内褶,细胞内可见吞噬体.结论 外路法是一种切实可行的视网膜色素上皮移植方法,移植后的细胞可存活并恢复正常的结构和功能.