脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的研究进展

人脐带间充质干细胞是一种从人脐带间质组织中分离出来的全能干细胞,具有自我更新、免疫缺陷和多向分化潜能。新近研究表明,人脐带间充质干细胞在体内微环境及体外细胞因子的作用下不仅能够分化为胰岛样细胞,而且具有一定的β细胞分泌功能,能够降低血糖,克服了胰岛移植治疗糖尿病所面临的供体细胞缺乏和免疫排斥反应问题,从而有望为临床糖尿病细胞治疗开辟了一条新的途径。     

脐带间质干细胞多向分化潜能的鉴定

目的:研究脐带间质干细胞的多向分化潜能,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源?方法:采用胶原酶胰酶消化脐带组织,将获得的细胞传代培养,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,再以不同方法使其向骨?脂肪?心肌和内皮细胞方向诱导,分别采用Von Kossa?油红O染色和免疫组化对分化的细胞进行鉴定?结果:脐带间质干细胞分别向成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性?在5-氮胞苷诱导后,心肌特异性抗体肌动蛋白α-actin和肌球蛋白myosin免疫组化染色阳性?在VEGF诱导后,细胞形成网格样结构,免疫荧光示CD31?CD34染色阳性?结论:脐带间质干细胞具有分化为骨?脂肪?心肌和内皮细胞的潜能,是非常有前途的心血管组织工程种子细胞来源?     

人骨髓间质干细胞体外培养诱导成为心肌样细胞的实验研究

目的 研究人骨髓间质干细胞的体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 取成人髂骨骨髓，分离出骨髓间质干细胞进行培养、传代。观察在培养液中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)条件下骨髓间质干细胞的生长和分化。结果 成人骨髓间质干细胞贴壁呈集落生长，有成纤维细胞样外观。5-aza诱导人骨髓间质干细胞转化为心肌样细胞。结论 人骨髓间质干细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，是心肌组织工程良好的细胞来源。     

成人骨髓间质干细胞向神经干细胞的诱导分化

目的:建立诱导成人骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向神经干细胞分化的体外培养方法,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞.方法:原代贴壁培养成人BMSCs并传代培养至第3代时,将细胞接种于铺有琼脂糖的培养瓶,用神经干细胞培养基(含B27,EGF,bFGF...     

人胚胎海马神经干细胞体外培养方法的建立

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量的差异。结果 :建立了人胚胎海马神经干细胞体外培养的优化条件 ,确立了最佳传代方法与时机。提示 :人胚胎海马神经干细胞在体外抑制分化的条件下可以长期处于未分化状态增生 ,并且可多次传代。     

在人类脐带上发现新的干细胞源有助于临床治疗

巴西科学家最近在人类脐带上发现新的干细胞源，这种间质干细胞被认为在临床治疗上能发挥很大作用。据此间媒体报道，以前人们在某些治疗中常使用脐带血，它含有造血干细胞，但只有10％的脐带血含有间质干细胞。巴西圣保罗大学科学家玛雅娜·卡茨等人最近发现，所有脐带都含有间质干细胞。科学家分析了10条脐带，并从每一条上都成功提取出了间质干细胞。     

人脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病足的临床研究

目的:观察人脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病足的临床疗效。方法:2型糖尿病并发糖尿病足患者5例。术前采用胰岛素控制血糖,完善检查后给予人脐带间质干细胞悬液病变下肢局部多点注射。结果:治疗后所有患者肢体疼痛缓解,冷感、间歇性跛行均有不同程度的改善,5例溃疡明显好转。结论:人脐带间充质干细胞移植治疗糖尿病足是一种简单、安全、有效的方法,能提高患者生活质量。     

人脐带间充质干细胞生物学特性及向成骨细胞分化的研究

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(WJ～MSCs),观察其生物学特性并研究其定向分化成成骨细胞的能力。方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小段,剥离血管后酶解,释放细胞贴壁生长,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第3代生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14和HLA～DR);化学染色检测其体外诱导成骨分化的能力。结果:原代人脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维样形态;流式细胞仪检测培养细胞间充质干细胞的表面标志CD105、CD73和CD90阳性表达,但不表达造血细胞的表面标志CD34、CD45、CD14及HLA-DR阴性表达,HLA-ABC低表达。体外诱导实验证实,该细胞具有成骨分化能力。结论:WJ-MSCs体外诱导成骨能力确切,具有类似骨髓间充质干细胞的特异性表面标记,且具有同种异体移植的低免疫原性。     

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的 研究由脐带华通胶组织(Wharton's jelly)在体外分离、培养、扩增获得脐带间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,以下简称UC MSCs)的方法,并进行UC- MSCs的各项鉴定.方法 脐带华通胶组织采用胶原酶以及胰酶序贯消化法分离得到UC-MSCs,用流式细胞仪分析其表型特征,向成骨、成脂以及成神经元细胞诱导分化并鉴定.结果 由人脐带华通胶可以有效获得间充质干细胞.原代细胞培养24～48 h内细胞开始贴壁生长,5～7 d左右可以传代培养,在2～3周时间内可以迅速扩增至107到108数量级.各项分化鉴定试验证实UC-MSCs具有多向分化潜能,能分化成骨、成脂细胞以及神经元细胞.UC-MSCs在体外培养传至20～30代仍保持稳定的细胞表面标记.结论 由人脐带华通胶可以有效地获得间充质干细胞,这种UC-MSCs能在体外长期传代培养,生物学特性稳定,具有多向分化的潜能,是今后细胞治疗很有前景的种子细胞.     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

人脐带间质干细胞的CM-Dil标记及其移植在急性肾损伤大鼠体内的示踪研究

目的:探讨人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)用CM-Dil染料标记之后生物学特性及体内定位示踪情况。方法:采用脐带组织块贴壁培养法分离人脐带间质干细胞,用CM-Dil染料标记第3代hucMSCs;采用细胞计数法分析CM-Dil标记后hucMSCs的生长变化情况;通过活体成像仪观察CM-Dil染料标记的hucMSCs移植于急性肾损伤大鼠后的体内定位。结果:CM-Dil染料标记hucMSCs的效率很高;标记后的hucMSCs生长增殖能力没有发生明显变化;体内示踪可以观察到标记的hucMSCs。结论:CM-Dil标记不影响hucM-SCs的生长增殖特征,并且能够在体内示踪,为后续研究提供了实验基础。     

肿瘤样干细胞来源的外泌体促进人脐带间充质干细胞的增殖和侵袭

目的探讨Piwil2诱导肿瘤干细胞（Piwil2-iCSC）来源的外泌体对人脐带间充质干细胞（hucMSCs）肿瘤样生物学行为的影 响。方法超速离心法提取Piwil2-iCSCs外泌体,透射电镜、粒径分析、Western blot及外泌体摄入实验检测外泌体形态、直径、标 志蛋白表达及作用途径。将hucMSCs 分为对照组、PBS干预组和外泌体干预组（Exo）,CCK-8、细胞划痕实验、Transwell 和 Western blot检测各组hucMSCs的增殖、迁移、侵袭能力以及基质金属蛋白酶（MMPs）MMP2和MMP9蛋白的表达水平。细胞 染色体核型分析检测经Piwil2-iCSCs外泌体长期干预的hucMSCs的染色体结构。结果透射电镜可见Piwil2-iCSCs外泌体大 小均匀,直径在50~100 nm,呈形态较规则的圆形或椭圆形囊泡状小体,粒径分析显示外泌体直径分布集中在在100~200 nm; Western blot显示外泌体标志性蛋白CD9、CD63和piwil2蛋白阳性表达;外泌体摄入实验表明外泌体进入细胞发挥作用。与对 照组和PBS干预组相比,Exo组细胞增殖数量明显增多（P<0.05）,划痕愈合速度加快（24 h,P<0.05;48 h,P<0.01）,侵袭细胞数目 显著增加（P<0.01）。经Piwil2-iCSCs外泌体干预后的hucMSCs细胞MMP2（P<0.05 vs PBS干预组,P<0.01 vs 对照组）、MMP9 蛋白水平表达增高（P<0.05）,但染色体核型仍是46XY,无异常。结论肿瘤样干细胞Piwil2-iCSC外泌体能促进hucMSCs的增 殖、迁移及侵袭,但是未出现肿瘤样异质性改变。     

体外扩增大鼠肌源性干细胞的安全性研究

目的:研究经体外扩增的大鼠肌源性干细胞的安全性,为将来肌源性干细胞移植治疗压力性尿失禁的临床应用提供参考。方法:分离培养出大鼠肌源性干细胞,在体外传代培养,对传至第10代(PP6-10)的细胞进行刀豆球蛋白A(ConA)凝聚实验、双层软琼脂培养实验初步分析细胞表面结构和生长特性是否发生恶变;采用免疫细胞化学的方法检测PP6-10的端粒酶活性以及c-myc,p53,c-fos肿瘤相关基因的表达情况;采用裸鼠皮下致瘤实验观察其是否具备致瘤性。结果:体外培养至第10代以内的大鼠肌源性干细胞在培养瓶底分布均匀,贴壁后多为纺锤形或梭形,与原代培养的肌源性干细胞形态相比无明显改变;在不同浓度的ConA溶液中,PP6-10均未产生凝聚反应;将PP6-10置于双层软琼脂中培养12d,未见细胞克隆形成,培养至20d,细胞数量明显减少;通过免疫细胞化学方法检测PP6-10中的c-myc,p53和c-fos等肿瘤相关基因的表达结果均为阴性,PP6-10中的端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达结果呈弱阳性;将不同浓度的PP6-10接种于裸鼠皮下,观察4个月后接种部位没有肿块形成,病检其接种部位以及肝脏、肺脏均无异常表现。结论:大鼠肌源性干细胞体外培养至第10代后没有发生突变,不具备体内致瘤性,初步证实了体外传至第10代的大鼠肌源性干细胞的安全性。     

施万细胞对共培养的神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨施万细胞诱导神经干细胞增殖与分化的影响因素。方法:大鼠胚胎神经干细胞单独培养及与新生SD大鼠施万细胞共培养,观察神经干细胞的形态变化,并分别检测特异性标志蛋白S-100、NF和GFAP的表达。结果:相差显微镜下可见共培养组大部分神经干细胞伸出多个细长突起;与单独培养组相比,免疫荧光染色显示共培养组NF表达阳性细胞数多;GFAP表达阳性细胞数少。结论:施万细胞可促进共培养的神经干细胞增殖,并可诱导神经干细胞向神经元方向分化。     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17．2神经干细胞凋亡的影响

OBJECTIVE: To study the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transfer on hypoxia-induced apoptosis of neural stem cells in vitro. METHODS: C17.2 neural stem cells cultured in vitro were infected by recombinant adenovirus containing VEGF gene and cultured under hypoxic condition. VEGF expression in these cells was detected by Western blotting, and the apoptotic index was calculated from results of triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL) assay. Flow cytometry was employed to examine the changes in the cell apoptotic rate after VEGF gene transfer, and the apoptotic bodies were observed under fluorescence microscope with Hoechst33342 staining. RESULTS: The expression of VEGF was significantly increased in pAdCMV VEGF(165)-infected cells, resulting in inhibition of the apoptosis of C17.2 neural stem cells induced by hypoxia manifested by a significantly lower apoptotic rate of the stem cells transfected by pAdCMV VEGF(165) than that of the untransfected cells (10.38%;+/-0.48%; vs 19.98 %;+/-0.55%;, P<0.01) and of the cells transfected with pAdCMV VEGF(165) along with VEGF anti-sense oligodeoxynucleotide (19.07%;+/-0.64%;, <0.01) after hypoxia. CONCLUSIONS: Recombinant adenovirus can efficiently mediate VEGF gene transfer into C17.2 neural stem cells, resulting in high expression of the exogenous VEGF in vitro, which effectively reduces C17.2 neural stem cell apoptosis induced by hypoxia.     

BDNF基因转染促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的: 将脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)基因转入骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),使其作为种子细胞和基因治疗的载体将BDNF基因导入脊髓损伤组织,为探索一种更为有效的脊髓损伤治疗方法提供实验基础。方法: 分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞;实验组应用已构建的pEGFP-N1-BDNF进行基因转染,空质粒组用pEGFP-N1空质粒进行转染,阴性对照组只加入培养基,并进行Western 印迹分析;将转染BDNF的实验组、转染空质粒组和未转染的阴性对照组细胞在体外向神经元样细胞诱导分化,比较3组细胞诱导后神经元样细胞分化率,并进行统计学分析。结果: 流式细胞检测培养细胞CD90(+),CD44(+), CD34(-)、CD45(-);经Western印迹检测证实实验组MSC表达BDNF-EGFP;实验组细胞向神经元样细胞分化率高于空质粒组和未转染的阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: BDNF基因转染MSC后,可以促进其向神经元样细胞分化,BDNF在MSC向神经元样细胞分化过程中具有重要作用。     

人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡对巨噬细胞极化的影响

目的: 探究人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡对巨噬细胞极化的影响。方法: Dil标记神经干细胞微囊泡,流式细胞仪和共聚焦显微镜观察THP-1巨噬细胞对微囊泡的内化;实时荧光定量PCR筛选微囊泡最适浓度;100 ng/mL 脂多糖刺激THP-1细胞6 h后,微囊泡处理12 h,实时荧光定量PCR检测巨噬细胞炎性因子IL-1β,肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)以及IL-6的mRNA表达水平;微囊泡处理24 h, 蛋白免疫印迹法检测诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)和精氨酸酶1 (Arginase-1, Arg-1)蛋白表达水平;流式细胞术检测THP-1巨噬细胞M1极化表面标志CD86表达。结果： THP-1巨噬细胞在12 h和24 h均能明显内化神经干细胞微囊泡;0.12 μg/mL微囊泡具有最适调控作用;与未处理细胞相比,脂多糖处理后明显增加THP-1细胞IL-1β,TNF-α,IL-6等mRNA和iNOS蛋白,Arg-1蛋白表达差异无统计学意义(P<0.05);经神经干细胞微囊泡处理后THP-1细胞IL-1β,TNF-α,IL-6等mRNA和iNOS蛋白表达明显降低(P<0.05);与未处理细胞相比,脂多糖和微囊泡处理后THP-1巨噬细胞CD86表达差异无统计学意义。结论： 人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡能够减少THP-1细胞炎性细胞因子和iNOS表达,抑制巨噬细胞M1极化。     

成人胰腺干细胞分离、培养及鉴定

目的：从成人胰腺组织中分离并鉴定胰腺干细胞。方法：利用含bFGF的有血清培养基分离、培养出具有高度增殖能力的细胞群，采用RT－PCR技术检测其Nestin mRNA及Insulin mRNA表达情况。同时诱导定向分化，观察其分化后的状态。结果：从成人胰腺组织中分离出的条索状细胞具有高度增殖能力，其Nestin mRNA表达阳性，而胰岛素Insulin mRNA表达阴性，分化后的细胞形成胰岛细胞团样结构。结论：本研究得到的细胞具有高度增殖能力和分化成胰岛细胞的潜能，是来源于胰腺的胰腺干细胞。     

低氧浓度改变对神经干细胞增殖分化及HIF-1α表达的影响

目的:探讨不同的低氧浓度下离体培养胎鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)的增殖分化及HIF-1α的表达情况,以此分析HIF-1α对神经干细胞的增殖分化作用。方法:体外低氧条件下(3%O2和10%O2)培养扩增胚鼠皮质来源的神经干细胞,实验组分为3%O2低氧1、3、5d组;10%O2低氧1、3、5d组,常氧为对照组。免疫细胞化学染色法鉴定神经干细胞及其子代细胞。RT-PCR检测实验组细胞HIF-1αmRNA的表达。结果:各低氧组NSCs内HIF-1αmRNA的表达量均明显高于对照组,且10%O2组与3%O2组相比,低氧5dHIF-1αmRNA的表达量显著增加;实验组NSE阳性神经元的比率均明显高于对照组,10%O2组与3%O2组相比,低氧5d10%O2组中NSE阳性神经元的比率明显增高。结论:低氧可促进NSCs增殖分化及HIF-1αmRNA的表达,且HIF-1αmRNA的表达量与低氧浓度及时间有关。     

骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。