体外培养人胚晶状体上皮细胞生长特性的研究

目的观察体外培养人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法组织块贴壁法培养人胚晶状体上皮细胞,通过倒置相差显微镜、透射电子显微镜,采用免疫细胞化学法分析人胚晶状体上皮细胞的生长特性。结果体外培养的原代人胚晶状体上皮细胞在组织块贴壁48～72 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点,第10天达到融合。第二代人胚晶状体上皮生长曲线近＂S＂形,经过1～2 d的潜伏期后进入对数生长期,需10 d左右达到融合,细胞形态呈六角形或椭圆形、超微结构保持正常,免疫细胞化学SABC法染色结果显示细胞浆内α-晶状体蛋白染色阳性。结论人胚晶状体上皮细胞具有增殖能力,第二代人胚晶状体上皮细胞是进行白内障相关研究的合适实验对象。     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

高糖刺激对大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素受体表达的影响

目的:观察体外高糖环境下大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素受体基因及其蛋白表达变化。方法:正常大鼠近端肾小管上皮细胞细胞株(NRK-52E)常规培养于含10%灭活新生胎牛血清的低糖DMEM培养液传代培养,待细胞生长至亚融合状态时,更换为无胎牛血清低糖DMEM培养基培养24h使其同步化,将NRK-52E细胞分为5组:A组为正常对照组,低糖DMEM完全培养液(含D-葡萄糖5.5mmol/L);B组为高糖刺激12h组:高糖DMEM完全培养液(含D-葡萄糖25mmol/L)刺激12h;C组为高糖刺激24h组:高糖DMEM完全培养液刺激24h;D组为高糖刺激48h组:高糖DMEM完全培养液刺激48h;E组为高糖刺激72h组:高糖DMEM完全培养液刺激72h。然后分别提取各组总RNA和总蛋白,分别用RT-PCR检测各组目的基因AdipoR 1/2mRNA的表达,Western印迹法检测各组目的蛋白AdipoR 1/2蛋白的表达。结果:脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2)在NRK-52E细胞中均有表达;在高糖刺激情况下,随着刺激时间的延长,目的基因AdipoR 1/2mRNA的表达均有先增高后降低的趋势,在刺激24h时升高到最高点,和对照组相比有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比,高糖刺激后各时间点AdipoR 1/2蛋白的表达有上升的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:NRK-52E细胞AdipoR1/2蛋白的表达不受高糖刺激的影响;高糖影响NRK-52E细胞AdipoR1/2mRNA的表达,并随着刺激时间的延长表现出先增高后降低。高糖通过影响脂联素受体基因的表达从而影响脂联素发挥其生物学作用,以致影响大鼠近端肾小管上皮细胞的功能。     

人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法的实验研究

目的比较K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基在人食管上皮细胞培养中的作用,并比较不同冻存方法对人食管上皮细胞复苏后存活率的影响,探讨适合应用于组织工程食管研究的人食管上皮细胞培养、冻存及复苏方法。方法人食管上皮细胞来源于食管癌患者手术切除的食管。采用组织块法和消化法培养,两种方法均分别加入K-SFM无血清培养基及DMEM有血清培养基。采用直接观察、锥虫蓝染色活力鉴定及细胞计数法绘制细胞生长曲线,对比细胞在不同培养基中的生长情况。分别以两种培养基配制的冻存液进行冻存,复苏后的细胞采用锥虫蓝染色法鉴定其存活率。结果细胞呈典型“铺路石”状排列,免疫组织化学检测细胞角蛋白呈阳性结果,证明培养的细胞为人食管上皮细胞。人食管上皮细胞在K-SFM无血清培养基中生长快,细胞形态好,不易被成纤维细胞污染。以K-SFM培养液配制的冻存液冻存的细胞复苏后的存活率明显高于以DMEM配制的培养液。结论应用K-SFM无血清培养基培养和冻存人食管上皮细胞的方法简便、培养效果好,适合推广应用。     

不同pH值的培养液对兔骨髓间充质干细胞体外培养的影响

目的　探讨不同pH值的低糖DMEM培养液对兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)体外培养的影响 ,寻找最适宜MSCs生长的培养液的pH值。方法　采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性的检查方法 ,观察不同pH值的低糖DMEM培养液对MSCs生长、增殖、形态的影响。结果　培养液的pH值在 7.2～ 7.4之间时 ,MSCs生长活跃 ,增殖速度极快 ,无接触抑制 ,镜下细胞呈单一梭形外观的成纤维细胞 ,形成成纤维细胞集落。pH值大于 7.4时 ,MSCs逐渐停止增殖 ,镜下细胞膜贴壁展开、边缘卷曲 ,细胞面积变大为正常的数倍 ,形态极不规则。pH值在 7.1～ 7.19之间时 ,变化不大 ,仅增殖速度稍减慢。pH值小于7.1时 ,MSCs生长增殖速度亦明显减慢 ,镜下细胞逐渐从培养瓶壁脱落 ,成为圆球形悬浮细胞。结论　MSCs对碱性的培养液较敏感 ,稍偏碱即影响生长增殖 ,对酸性的培养液则有一定的耐受。使用培养液前有条件也最好用pH计测定pH值 ,同时注意观察细胞生长增殖情况及培养瓶中培养液的颜色 ,以便及时换液     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

新生大鼠上丘脑组织培养研究

目的探讨新生大鼠上丘脑组织培养方法,并对其在培养过程中的变化进行观察。方法取出生4 d的SD乳鼠上丘脑组织,分别在鼠尾胶原玻片、多聚赖氨酸玻片和B iocoat培养小室上进行组织培养,使用相差显微镜动态观察组织块生长情况。48 h后观察组织块贴壁率,在培养5 d时使用图像分析仪观察细胞迁移情况,测量最大迁移距离。使用乳酸脱氢酶试剂盒,测量组织培养液中乳酸脱氢酶活性的动态变化。常规HE染色形态学观察,并使用透射电镜观察组织块超微结构。结果与传统的培养载体相比,上丘脑组织在B iocoat培养小室上进行培养可以获得较高的组织贴壁率和细胞迁移距离。上丘脑组织在接种后31~5 d,其培养液中乳酸脱氢酶活性保持在较低水平。培养早期上丘脑组织块边缘出现细胞突起,胶质细胞迁移,随着培养时间延长,细胞出现凋亡,组织结构破坏。结论B iocoat培养小室是进行新生大鼠上丘脑组织培养的理想载体,接种3 d后组织生长趋于旺盛,而在2周后多数组织的生长逐渐衰退。     

新生大鼠上丘脑组织培养研究

目的探讨新生大鼠上丘脑组织培养方法,并对其在培养过程中的变化进行观察.方法取出生4 d的SD乳鼠上丘脑组织,分别在鼠尾胶原玻片、多聚赖氨酸玻片和Biocoat培养小室上进行组织培养,使用相差显微镜动态观察组织块生长情况.48 h后观察组织块贴壁率,在培养5d时使用图像分析仪观察细胞迁移情况,测量最大迁移距离.使用乳酸脱氢酶试剂盒,测量组织培养液中乳酸脱氢酶活性的动态变化.常规HE染色形态学观察,并使用透射电镜观察组织块超微结构.结果与传统的培养载体相比,上丘脑组织在Biocoat培养小室上进行培养可以获得较高的组织贴壁率和细胞迁移距离.上丘脑组织在接种后3～15 d,其培养液中乳酸脱氢酶活性保持在较低水平.培养早期上丘脑组织块边缘出现细胞突起,胶质细胞迁移,随着培养时间延长,细胞出现凋亡,组织结构破坏.结论Biocoat培养小室是进行新生大鼠上丘脑组织培养的理想载体,接种3 d后组织生长趋于旺盛,而在2周后多数组织的生长逐渐衰退.     

大鼠骨髓间充质干细胞分离、体外培养和向软骨细胞表型定向分化的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取大鼠四肢骨髓,Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法得到MSCs,在含15％FBS的低糖DMEM培养液中,置于37C,5％CO2培养箱内培养10～14d。传代后以15％FBS的高糖DMEM培养液(含TGF-β110μg／L,地塞米松10^-7mol／L,维生素C50mg／L)对其进行诱导培养。观测在体外培养条件下MSCs的形态、生长特点和诱导培养后软骨特异性基质的表达情况。结果：①分离获取了较高纯度的MSCs,保持了细胞的活性;②MSC5原代培养呈均匀分布的集落样生长,呈长梭形;传代培养中形态特性无明显变化,细胞增殖周期缩短,细胞均质性明显提高;⑧诱导后的细胞由梭形向多角形转变,Ⅱ型胶原免疫组化阳性。结论：①采用Percoll梯度分离液离心分离结合贴壁筛选法可获得较高纯度和活性的MSCs;②MSCs在体外培养条件下能大量增殖。通过离体培养,可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增;③MSCs在特定培养液的诱导下能向软骨细胞表型转化,并能分泌软骨特异性基质,可成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。     

基于HIF-1α/ERK通路探讨异丙酚对缺氧大鼠海马神经元线粒体损伤的影响

目的 观察异丙酚通过缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/细胞外调节激酶(ERK)通路对缺氧大鼠海马神经元线粒体损伤的影响。方法 新生SD大鼠离体培养原代海马神经元细胞，随机分为6组。对照组(高糖DMEM培养液)、缺氧组(低糖DMEM培养液)、LP组(3 mg/L异丙酚的低糖DMEM培养液)、MP组(6 mg/L异丙酚的低糖DMEM培养液)、HP组(12 mg/L异丙酚的低糖DMEM培养液)及U0126组(终浓度12 mg/L异丙酚+50μmol/L U0126的低糖DMEM培养液)。缺氧组、LP组、MP组、HP组及U0126组于缺氧条件培养24 h；对照组于有氧条件培养24 h。透射电镜观察各组海马神经元细胞形态；MTT法检测细胞存活率；激光共聚焦显微镜检测Ca²⁺、活性氧(ROS)的荧光强度；酶联免疫吸附试验检测细胞钙调神经磷酸酶(GaN)活性；Western blotting检测HIF-1α、ERK1/2、p-ERK1/2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达。结果 缺氧组线粒体损伤严重，LP、MP和HP组线粒体损伤均有所减轻，HP组减...     

大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

输卵管上皮细胞的培养及生物学特性

目的建立输卵管上皮细胞的培养方法，进行形态学观察，鉴定及冻存，方法取雌性日本大白兔的输卵管上皮细胞进行原代及传代培养，用光镜，电镜及单克隆角蛋白抗体进行ＳＰ染色，结果输卵管上皮细胞呈多角形组成簇生长。电镜下可见表面有微绒毛，细胞之间有紧密连接等上皮细胞的特征，免疫组化染色上皮细胞角蛋白染色阳性，原代培养细胞７天长成单层，传代细胞４天长成单层，结论建立稳定的输卵管上皮细胞的培养方法，为进一步研究输卵     

有血清和无血清培养基联合法培养原代人牙龈上皮细胞

目的:探讨一种方便、快速、原代培养成功率高的人牙龈上皮细胞培养方法.方法:用含血清的DMEM培养基培养人牙龈组织上皮层7～10 d,然后换用无血清的EpiLife角化上皮细胞专用培养基加速已移出的上皮细胞分裂、增殖和游走.对培养出的上皮细胞进行组织学、形态学检测、单克隆角蛋白的鉴定和生长曲线测定.并比较联合培养方法和其他两种单独应用有血清DMEM培养基或无血清EpiLife培养基对上皮细胞生长的影响.结果:17～22 d内可获得供实验用上皮细胞,原代培养成功率为90.6%.倒置显微镜下见上皮细胞排列紧密,呈铺路石样生长.免疫组化染色角蛋白抗体阳性.同有血清培养基相比,无血清培养基能促进上皮细胞的迁移、游走,加速其分裂、增殖.结论:用有血清培养基和无血清培养基联合培养,可以方便、快速、成功地培养出人原代牙龈上皮细胞.     

人外周血树突细胞的分离与提纯

目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞（ＤＣ）。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞,培养２小时后,取会细胞,在无血清培养基中加入不同的细胞在子,于２的第１,６,８天对形态,表型和功能分擀行测定,并在光镜、电镜下观察ＤＣ的纯度与得率。结果 体外培养６～８天可获得高纯度大量的ＤＣ,较高表达ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８３和ＣＤ８６,能强烈激发同种慢体Ｔ淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血     

人晶状体上皮细胞体外培养方法的改良

目的改良现有人晶体上皮细胞的培养方法,建立稳定的体外培养模型。方法用改良培养法对人胚胎眼晶体前囊膜进行培养,并利用形态学检查方法进行检测和鉴定。结果组织块法在加入培养基24 h内即可见细胞生长,且保持上皮细胞形态,1wk左右细胞融合。在体外可传5代以后细胞衰老,存活者呈成纤维细胞状。消化法中2 d后见细胞壁生长,1周左右细胞融合。结论成功地改进了建立晶状体上皮细胞体外培养模型的方法,为研究后囊膜混浊发病机制提供了方法学基础。     

5-氮胞苷对贵州小型猪淋巴细胞DNA损伤及修复的影响

应用组织块静置培养法建立成年水牛晶状体上皮细胞的离体培养方法,通过细胞计数法、MTT法和透射电镜法观察,对晶状体上皮细胞的离体培养和冻存复苏的可行性进行研究,结果显示离体培养和冻存复苏后的晶状体上皮细胞生长良好且二者无显著差异(P>0.05),并保持了原有上皮细胞的特性及细胞结构。提示组织块静置培养法是适宜的晶状体上皮细胞培养方法,液氮冷冻可有效地保存晶状体上皮细胞。     

”微岛“原代培养新生大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元

目的 探讨“微岛”原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元的方法,研究不同培养液维持多巴胺能神经元存活和生长的效果,及多巴胺能神经元与其他神经元在“微岛”上的共培养,为多巴胺能神经元的相关研究提供一种新的细胞模型。方法 利用神经细胞不能粘附于琼脂糖上生长的原理,先用琼脂糖制成非粘附性底物,再将胶原喷洒其上形成粘附性的“岛”样底物,接种神经胶质细胞形成微岛样饲养层后,将大鼠中脑腹侧神经元接种于“微岛”上生长。结果 中脑腹侧多巴胺能神经元可在“微岛”上生长,即使单个神经元也生长良好。在共培养时,能与其他神经元形成突触联系。结论 确定适于“微岛”原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元的培养条件,该培养法可为多巴胺能神经元的相关研究提供一种新的细胞模型。     

重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子体外抗血管内皮细胞增殖的活性

目的：研究重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）体外抗血管内皮细胞增殖的活性。方法：MTT法检测重组人可溶性VEGI对血管内皮细胞及肿瘤细胞增殖的抑制活性。结果：在体外,重组人可溶性BEGI可强烈抑制人脐静脉内皮细胞ECV304、大鼠肺源毛细血管内皮细胞（MPCEC）及新生牛主动脉内皮细胞（BAEC）的增殖,不能报制黑色素瘤细胞B－16和小鼠成纤维细胞L－929的增殖。结论：重组人可溶性VEGI能作用于不同来源的血管内皮细胞,而对肿瘤细胞增殖无抑制作用,提示其可能通过抗肿瘤新生血管生成而发挥抗肿瘤作用。     

人脑神经干细胞的分离培养和鉴定

目的 探讨人脑神经干细胞的分离培养和鉴定方法。方法 采用无血清培养液从人胚胎脑皮质分离和培养神经干细胞，并应用免疫荧光技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向化潜能的鉴定。结果 鉴定表明从人胚胎脑皮质分离培养的细胞具有神经干细胞的特征，并可在体外增殖，经诱导可分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。结论 从人胚胎脑皮质成功分离培养了神经干细胞，它是研究细胞诱导分化的良好模型。