BMP8B对人牙周膜干细胞分化增殖的影响

目的:探讨骨形成蛋白8B(BMP8B)对人牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖、分化的影响。方法:体外分离培养人PDLSCs,免疫荧光染色检测PDLSCs细胞蛋白基质细胞抗原1(STRO-1)、CD146蛋白。将PDLSCs细胞分为对照组、阴性转染组、BMP8B沉默组和BMP8B过表达组。流式细胞术、茜素红染色和油红O染色对PDLSCs进行鉴定。CCK-8法检测细胞增殖情况。对PDLSCs进行成骨诱导，检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。茜素红染色检测成骨细胞矿化结节。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中BMP8B、Osterix、OCN、Runx2 mRNA表达水平，蛋白免疫印迹(WB)检测细胞蛋白表达情况。结果:显微镜下观察PDLSCs细胞为单核、多边形或梭形，具有成骨潜能和成脂潜能。与对照组和阴性转染组相比，BMP8B沉默组细胞增殖情况、ALP活性、茜素红染色程度及BMP8B、Osterix、OCN、Runx2 mRNA和CyclinD1、CDK2、Osterix、OCN、Runx2蛋白表达显著降低(P<0.05)。与对照组和阴性转染组相比，BMP8B过表达组各项...     

人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力的差异

目的 比较处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)和恒牙牙髓干细胞(DPSCs)的成骨分化及破骨能力,探讨两者在成骨和破骨相关分子的表达情况.方法 体外分离、培养和纯化处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞与恒牙牙髓干细胞;两种干细胞在成骨诱导14d和21 d,分别进行ALP染色、茜素红染色,并通过Real-time PCR检测SHED和DPSCs矿化诱导后的成骨与破骨相关基因表达.结果 倒置显微镜下观察,SHED和DPSCs形态均为长梭形;两种干细胞经矿化诱导后,茜素红染色可见SHED的矿化结节计数多于DPSCs(P＜0.05),SHED的ALP活性亦强于DPSCs(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,经矿化诱导后两种干细胞均表达成骨与破骨相关基因Runx2、OCN、ALP、OPG和RANKL,但DPSCs的Runx2、OCN和ALP的表达水平均低于SHED (P＜0.05),且SHED反应细胞破骨/成骨能力的RANKL/OPG的比值显著高于DPSCs(P＜0.05).结论 与DPSCs相比,SHED不仅具有较强的成骨分化能力,还兼有较强的破骨能力,为SHED参与生理性根吸收骨改建的调控机制提供实验依据.     

不同成骨诱导作用下骨髓间充质干细胞的基因表达模式

目的研究骨髓间充质干细胞不同成骨分化模式的分子调控机制，为将其作为骨组织缺损基因治疗的载体细胞奠定理论基础。方法用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），传代扩增后分别用矿化培养基（100nmol／L地塞米松、10mmol／Lβ-甘油磷酸钠和50mg／mL抗坏血酸）与重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2，500ng／mL）进行诱导。分别于诱导后1、2周行茜素红染色鉴定钙结节形成情况；诱导后1、2和3d时用RT-PCR检测Runx2、Osx、OCN和ColⅠ的基因表达情况。结果矿化诱导组和rhBMP-2诱导组，茜素红染色均呈阳性钙结节，但矿化诱导组细胞于1周后形成矿化结节，时间早于rhBMP-2诱导组（2周后形成矿化结节）；RT-PCR显示，在矿化诱导组，Runx2在诱导的1、2、3d均没有表达，Osx在诱导后2、3d有表达，OCN和ColⅠ在诱导的1、2、3d均有表达；在rhBMP-2诱导组．Runx2和Osx于诱导的第2d开始表达，OCN和ColⅠ在诱导的1、2、3d均表达。结论与rhBMP-2相比，矿化培养基通过更为直接的信号传导方式调控着骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，因此矿化培养基诱导骨髓间充质干细胞形成矿化结节的能力强于rhBMP-2。     

p38丝裂原活化蛋白激酶在炎症微环境作用下对牙周膜干细胞成骨分化的影响

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在慢性牙周炎组织来源的牙周膜干细胞中的表达及其对炎症微环境作用下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 2012年10月至2013年5月收集中国人民解放军总医院口腔科因治疗需要拔除的无龋前磨牙及慢性牙周炎牙齿,培养正常及炎症微环境下的牙周膜干细胞(H-PDLSCs,P-PDLSCs)。采用酶联免疫吸附试验及实时定量PCR检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β的分泌及基因表达量,免疫荧光检测p38在细胞内的表达,Western blot法检测两种细胞成骨诱导7 d后p38及磷酸化p38(p-p38)的表达。使用p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580干扰后体外成骨诱导7 d,实时定量PCR检测细胞成骨关键基因Runx2和碱性磷酸酶(ALP)的基因表达水平,成骨诱导21 d后茜素红染色检测PDLSCs的矿化结节形成情况。结果 P-PDLSCs的TNF-α和IL-1β分泌量均显著高于H-PDLSCs(68.80±6.70比34.10±3.07,P=0.001;57.10±4.23比26.90±2.58,P=0.000)。P-PDLSCs中TNF-α的基因表达水平较H-PDLSCs上升1.4倍(P=0.011),IL-1β的基因表达水平也上升1.7倍(P=0.009)。P-PDLSCs的p38表达量高于H-PDLSCs;成骨诱导后两种PDLSCs中的p-p38表达均升高,但p38表达水平有所降低。SB-203580干扰后PDLSCs的Runx2和ALP表达水平显著降低(H-PDLSCs:P=0.044、0.036;P-PDLSCs:P=0.017、0.004),矿化结节形成数量减少。结论在慢性炎症微环境中,p38 MAPK参与细胞的炎性反应,抑制p38后炎症微环境作用下PDLSCs的成骨分化能力也被显著抑制。     

Sirt1促进炎症牙周膜干细胞成骨分化的机制

目的 探讨去乙酰化酶1(Sirt1)对炎症牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的作用，并研究其可能的分子机制。方法 分离、培养正常及炎症PDLSCs,观察Sirt1在两种细胞中的表达；将炎症PDLSCs进行成骨诱导，同时使用Sirt1激动剂白芦藜醇上调炎症PDLSCs中的Sirt1,观察炎症PDLSCs的成骨分化情况，Western blot检测Runx2、乙酰化NF-κB、乙酰化FoxO1和FoxO1的表达。结果 炎症PDLSCs中Sirt1的表达较正常PDLSCs减少(P<0.01);白芦藜醇可上调炎症PDLSCs中Sirt1的表达；与成骨诱导组比较，成骨诱导+白芦藜醇组炎症PDLSCs中BSP(t=14.045,P<0.01)、Runx2(t=3.349,P<0.01)、OCN(t=7.218,P<0.01)和Osx (t=4.544,P<0.01)mRNA的表达增加，ALP染色增强(P<0.01);炎症PDLSCs成骨诱导后FoxO1(t=8.737,P<0.01)和Runx2(t=6.152,P<0.01)的表达增强；使用白芦藜...     

Purmorphamine promotes osteogenic differentiation in human periodontal ligament stem cells under dynamic tensile

目的 研究purmorphamine在动态张应力促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSCs)向成骨细胞分化过程中的作用.方法 分离培养鉴定PDLSCs,在矿化诱导环境中加入purmorphamine,采用Flexcell FX4000T应力加载系统对细胞加力24 h,以Red-time PCR检测成骨相关指标Runx2、alkaline phosphatase(ALP)以及Hedgehog(Hh)通路的标志物GLI1、Pathed1( PTCH1)、Smoothend(SMO).结果 动态张应力作用24 h后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GHI1、PTCH1、SMO的表达水平明显升高(P＜0.05);加入purmorphamine后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平较加力组均有增强,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 purmorphamine可能通过激活Hh通路,进而增强人PDLSCs应力条件下向成骨细胞分化.     

purmorphamine促进人牙周膜干细胞应力成骨

目的研究purmorphamine在动态张应力促人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSCs)向成骨细胞分化过程中的作用。方法分离培养鉴定PDLSCs,在矿化诱导环境中加入purmorphamine,采用Flexcell FX-4000T应力加载系统对细胞加力24 h,以Real-time PCR检测成骨相关指标Runx2、alkaline phosphatase(ALP)以及Hedgehog(Hh)通路的标志物GLI1、Pathed1(PTCH1)、Smoothend(SMO)。结果动态张应力作用24 h后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平明显升高(P<0.05);加入purmorphamine后,成骨相关指标Runx2、ALP,Hh通路的标志物GLI1、PTCH1、SMO的表达水平较加力组均有增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 purmor-phamine可能通过激活Hh通路,进而增强人PDLSCs应力条件下向成骨细胞分化。     

颌骨骨髓基质细胞对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的观察间接共培养犬颌骨骨髓基质细胞(canine maxillary bone marrow stromal cells, cM-BMSCs)对犬牙周膜细胞(canine periodontal ligament cells, cPDLCs)生物学特性的影响。方法 原代培养犬颌骨骨髓基质细胞和犬牙周膜细胞。MTT法检测犬牙周膜细胞增殖速率;利用Transwell结构建立犬颌骨骨髓基质细胞与犬牙周膜细胞共培养体系;qPCR法检测犬牙周膜细胞矿化相关基因核心结合因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)的变化;Western印迹法检测Runx2和OCN蛋白的表达变化。构建牙片/细胞膜片复合体植入裸鼠皮下。结果 两种细胞体外均贴壁生长,呈纺锤状外形;颌骨骨髓基质细胞间接共培养下对牙周膜细胞增殖有抑制作用;共培养组牙周膜细胞ALP活性高于对照组;qPCR和Western印迹法均能检测到牙周膜细胞Runx2、OCN的表达,共培养组牙周膜细胞的Runx2和OCN的表达均高于对照组。经过颌骨骨髓基质细胞条件培养液诱导后的牙周膜细胞与牙本质片复合形成了排列更加有序的牙周膜/牙骨质样结构,单纯的牙周膜细胞膜片不能新生类似的牙周组织复合结构。结论犬颌骨骨髓基质细胞间接共培养情况下可能会限制牙周膜细胞的增殖,促进牙周膜细胞向成骨样细胞分化。     

不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 研究不同糖浓度对颌骨骨髓间充质干细胞（orofacial bonemesenchymal stem cells, OFMSCs）增殖和成骨分化的影响。方法 体外分离、培养OFMSCs,成骨、成脂、成软骨分化诱导及鉴定,并使用不同含糖量培养基（5.5、11、16.5、25、44 mmol/L）培养OFMSCs,以5.5 mmol/L基准糖浓度为对照组,其余组为实验组。采用CCK-8及流式细胞仪检测各组OFMSCs的增殖活性及增殖指数,OFMSCs成骨诱导后4、7 d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,21 d进行茜素红染色及矿化定量分析,同时用RT-PCR检测3、7、14及21 d相关成骨基因Runx2、Osterix的表达。结果 培养的OFMSCs成骨诱导21 d后茜素红染色可见钙结节,成脂诱导14 d 后油红O染色可见红色脂滴,成软骨诱导14 d 后阿利新蓝染色可见蓝色胞浆;糖浓度在5.5～25 mmol/L促进OFMSCs的增殖,但随着糖浓度的继续增加（25～44 mmol/L）,OFMSCs的增殖活性受抑制;成骨诱导时,随着培养液糖浓度升高,ALP活性呈剂量依赖性降低（P <0.05）;成骨诱导21 d ,茜素红染色和矿化定量分析显示,随着培养液糖浓度的升高,钙结节形成、矿化定量呈剂量依赖性减少;成骨诱导3、7、14及21 d ,RT-PCR检测结果显示,对照组Runx2、Osterix mRNA 表达量高于实验组（P <0.05）,各组Runx2、Osterix mRNA 表达量均出现先上调再下调的趋势。结论 在一定范围的糖浓度内,糖浓度升高可促进OFMSCs的增殖;而糖浓度升高对成骨分化呈抑制效应。     

高浓度葡萄糖对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的观察高浓度葡萄糖刺激下牙周膜干细胞(PDLSCs)的增殖能力和成骨分化能力。方法组织块法体外培养非糖尿病患者PDLSCs,分别用0mg/L(正常对照组)、1100mg/L(低糖组)、4500mg/L(高糖组)浓度葡萄糖刺激,MTT法检测PDLSCs增殖能力,矿化诱导后茜素红染色观察矿化结节形成,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runt相关转录因子2(Runx-2)、碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原(Col-1)成骨相关基因表达。结果 MTT法检测显示高糖组OD值较低糖组和正常对照组低(P0.05);21天成骨诱导后,高糖组矿化结节面积少于低糖组和正常对照组(P0.05,P0.01);成骨诱导期间,高糖组ALP、Runx2和Col-1诱导前后相对倍增数低于低糖组和正常对照组(P0.05,P0.01)。结论高浓度葡萄糖抑制PDLSCs增殖能力和成骨分化能力。