改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体构建及表达的实验研究

目的 研究改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达.方法 首先通过基因拼接法合成VP3基因并委托生物技术公司合成改良型TAT基因.然后于原核表达载体pGEX-6p-1上构建改良型TAT-VP3融合蛋白的基因.最后将构建好的原核表达载体转导入基因工程菌DH-5α中并诱导其表达.结果 成功合成了VP3基因,构建了改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达载体,并经基因测序证明构建无误;成功的在基因工程菌DH-5α中诱导了改良型TAT-VP3融合蛋白的表达.结论 改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达是可行的,为进一步的蛋白制备及活性研究打下了基础.     

改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体的构建及表达

目的 构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白.方法 采用PCR法设计和扩增改良型TAT-VP3融合基因,克隆至表达载体pThioHisA中,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE鉴定.结果 成功构建了改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,经酶切、测序鉴定,证明构建正确.经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量16400的特异性目的 条带,37℃诱导8h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在.结论 已成功构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白,为进一步的蛋白制备和应用研究奠定了基础.     

HIV-1 HXB2株蛋白酶的原核表达、纯化及其Gag蛋白CAP2NC的切割活性分析

目的:原核表达、纯化HIV-1型HXB2株蛋白酶(protease,PR),用于对HIV-1 Gag P2/NC蛋白酶切割位点序列随机突变的噬菌体展示文库的切割筛选及构建新的蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)类药物体外筛选模型.方法:根据HIV-1 HXB2株PR DNA序列设计引物,在PR序列上游添加自切割位点MGTVSFNF 8个氨基酸编码获得PR107 DNA编码序列,将PR107 DNA克隆至原核表达载体pET-32a,序列测定后转化大肠杆菌BL21 DE3进行诱导表达.表达产物经用Ni-NTA亲和柱纯化,经复性后,进行靶蛋白CAP2NC切割试验,SDS-PAGE检测切割结果.结果:成功合成了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR107的DNA编码序列,序列测定显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致;成功构建了HIV-1 PR原核表达质粒pET32a-PR107,转化大肠杆菌BL21 DE3经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为30 000的HIV-1 PR融合蛋白,纯化的目的蛋白浓度为2.54 mg/ml;纯化蛋白经复性后具有对底物蛋白CAP2NC的切割活性,该作用能被PI药物抑制.结论:成功构建大肠杆菌偏好密码子带自切割位点的HIV-1 PR原核表达载体pET32a-PR107,在大肠杆菌中表达,经纯化复性获得了具有切割活性的HIV-1 PR融合蛋白.     

癌胚抗原单链抗体-链亲和素融和蛋白的功能鉴定

目的: 用pET21原核表达系统表达癌胚抗原单链抗体-链亲和素融合蛋白.方法: 融合表达载体转化大肠杆菌菌株HMS174(DE3),用1mmol/L的IPTG诱导表达,表达产物行亲和印迹及免疫斑点分析.结果: SDS-PAGE表明,融合蛋白分子质量约57ku,亲和印迹及免疫斑点证实融合蛋白具有结合CEA与生物素的双特异性.结论: 原核表达系统可以表达具有双特异性的融合蛋白,该融合蛋白利用生物素标记的辣根过氧化物酶可直接检测抗原.     

创伤弧菌溶血素基因的高效表达与鉴定

目的:构建创伤弧菌溶血素基因(vvs)的融合表达载体,并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达.方法:用一对创伤弧菌溶血素基因特异性引物从创伤弧菌基因组DNA中钓取眦基因,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET-32a( )-vvc融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物行SDS-PAGE并进行West-ern Blot鉴定.结果:构建了pET-32a( )-vvc融合表达载体,DNA测序证明,获得的vvc基因长度为1311 bp,与Gen-Bank中报道的创伤弧菌溶血素基因序列完全一致.SDS-PAGE分析表明,vvc融合蛋白Mr为71×103,其表达量约占菌体总蛋白的32%.Western blot结果显示,目的蛋白可与创伤弧菌免疫后的小鼠血清特异性结合.结论:成功地实现了VVC基因在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究僦蛋白的生物学功能奠定基础.     

人肠三叶肽在大肠杆菌中的表达

目的 构建三叶肽(TFF)原核重组质粒pET32a-TFF3,实现TFF3融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达并鉴定表达产物.方法 用Trlzol试剂提取人结肠组织mRNA,逆转录后经PCR扩增得到不含信号肽的TFF3编码序列,插入原核表达载体pET32a,构建pET32a-TFF3重组质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果 酶切和测序证实pET32a-TFF3重组质粒构建成功.SDS-PAGE分析表明在IPTG浓度为1 mmol/L时,诱导6 h后蛋白表达量最大.Western blot分析表明,TFF3融合蛋白相对分子质量约为24×10~3,其能与兔源TFF3抗体特异性结合.结论 成功构建了pET32a-TFF3重组质粒,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为后续深入研究TFF3奠定了基础.     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据.方法:利用 PCR 技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性.结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp.经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%.结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础.     

人IκBα基因的克隆和原核表达

目的:构建人类IκBα基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,为研究IκBα基因的功能奠定基础。方法:从cDNA文库获取目的基因,经PCR扩增目的片段IκBα;利用分子克隆技术构建原核表达质粒;转化入大肠杆菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,进行纯化,获得目的蛋白。结果:成功构建pET-28a-IκBα重组表达质粒;经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示:IκBα在pET-28a-IκBα表达载体中获得表达量较高的融合蛋白,主要以上清形式存在。结论:成功表达并纯化获得了高纯度的IκBα蛋白。     

人组织型谷氨酰胺转氨酶基因的克隆 表达及纯化

目的:克隆人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,并进行原核表达及纯化.方法:从Caco-2细胞中提取总RNA,利用RT-PCR克隆人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,然后将其连接到原核表达载体pET-32a.将构建成功的重组表达载体pET-32a-TG2导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达His-TG2融合蛋白.用Ni-NTA蛋白纯化柱对融合蛋白进行纯化,采用Western Blotting检测重组蛋白的特异性.结果:成功克隆出人组织型谷氨酰胺转氨酶基因,构建了pET-32a-TG2原核表达载体,并成功诱导了重组融合蛋白His-TG2的表达.结论:构建了表达人组织型谷氨酰胺转氨酶基因的原核表达系统,并成功对重组蛋白进行了纯化.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

上颌骨牙源性囊肿刮除手术的疗效观察

目的探讨对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术的临床疗效。方法对我科在2010年1月～2017年9月收治的73例上颌骨牙源性囊肿患者行囊肿彻底刮除手术治疗,对患者术区肿胀消退、术后伤口感染、伤口愈合、牙龈再附着、术后复发、骨质改建、骨质修复等情况随访观察。结果 73例患者术后肿胀消退时间为1～4 d。73例患者术后均未发生伤口感染,伤口均一期愈合。所有患者牙龈再附着情况好,术后均未见复发。术后未见并发症。骨质改建效果好,骨质修复的效果因影像学资料过少,缺乏客观依据,暂不下有效结论。结论对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术,术后患者的恢复情况良好,值得在临床治疗上进行推广。     

十二指肠损伤的治疗体会

目的：提高十二指肠损伤的诊治水平，方法：回顾总结该院1999年－2001年间收治的十二指肠损伤7例临床经验。结果：合并其他腹部脏器损伤86％（6／7），单纯十二指肠损伤14％（1／7）。损伤部位以十二指肠降部为多占71％（5／7），水平部和球部各占14％（1／7），术后并发症发生率28％（2／7）、病死率14％（1／7）。结论：掌握十二指肠损伤的特点，早诊断、早手术、术中认真探查，掌握好检查指征，选择合理恰当术式，加强术后管理，可提高治愈率。     

新生儿103例尸检分析

对我院近十年的103树新生儿尸检结果进行死因分析，呼吸系统疾病占61．17％，颅内出血占29．13％。7天内死亡者占90．29％，出生低体重儿占死亡者的76．70％，出生时系难产者占死亡者的60．19％。出生后有窒息者占死亡者的69．90％，临床诊断与病理诊断不符占25．24％。     

27例子宫肌瘤变性临床分析

目的探讨子宫肌瘤的临床特征及诊疗。方法对经病理检查证实为子宫肌瘤变性患者27例的临床资料进行回顾性分析。结果变性的子宫肌瘤与非变性的子宫肌瘤的临床表现极为相似（红色变性除外），其症状与肿瘤生长部位及大小有关。结论变性子宫肌瘤的特殊临床症状，结合超声检查的声像图分析，总结出子宫肌瘤变性的诊断要点及手术方法，提高了子宫肌瘤变性的诊断率和治疗效果。     

浅谈影响放疗摆位精度的相关因素

本文旨以经验交流的方式,阐述影响放疗摆位精度的各种相关因素,以最大努力去消除或减少放疗摆位误差,提高放疗摆位的精度,同时达到与放疗界其他同行的共勉的愿望。     

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的：动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法：选用2--3kg新西兰大白兔64只，分为2大组，快速扩张组和常规扩张组，每组32只，每大组再分为4组，为扩张完成后即时、1周、12周、24周组。每组8只，其中4只为实验组，另4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果：表皮扩张后经历--由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生，功能由静止转向活跃，胶原纤维碎裂成片，弹力纤维部分断裂，炎症细胞浸润；扩张后1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复。显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后12周、24周，成纤维细胞趋于稳定、形态狭长，部分胶原排列紊乱，部分有似癜痕样改变。结论：扩张刺激可致兔皮肤创伤。扩张后真皮不可完全修复。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用

目的观察芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用。方法30只Long-Evans大鼠用动脉结扎法造成视网膜缺血模型,其中治疗组20只腹腔注射芹黄素,对照组10只注射溶媒二甲基亚酚。用视觉电生理仪检查视网膜功能恢复情况。结果芹黄素治疗组视网膜功能恢复明显好于对照组(P<0.05)。结论芹黄素能促进大鼠缺血视网膜的功能恢复。