IL-21对恒河猴SHIV特异性CD8+T细胞毒性效应的影响

目的探讨白细胞介素21(interleukin 21, IL-21)对SHIV特异性CD8⁺ T细胞毒性效应的影响。方法定时采集16只SHIV感染恒河猴的外周血,应用实时荧光定量RT-PCR测定病毒载量,流式细胞仪测定CD8⁺ T细胞绝对数,并且体外检测经IL-21刺激SHIV特异性CD8⁺ T细胞后其IL-21R、CD107a及胞内穿孔素(perforin)的表达水平。结果体内实验结果表明外周血病毒载量和CD8⁺ T细胞绝对数之间呈一定程度的负相关。体外实验结果表明SHIV特异性CD8⁺ T细胞经IL-21刺激后其细胞表面表达的IL-21R显著上调,而且perforin⁺ CD8⁺T细胞和CD107a⁺ CD8⁺T细胞的百分比上升,同未经刺激的对照组相比具有统计学差异。结论IL-21能够促进SHIV特异性CD8⁺T细胞的毒性效应。     

MSCs通过促分泌TGF-β1、IL-6和IL-10抑制干燥综合征患者CD4+T细胞的活化增殖

目的 体外探讨人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)对原发性干燥综合征(primary Sjgren syndrome, pSS)患者外周血活化CD4⁺ T细胞的免疫抑制效应,分析MSCs促分泌的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、IL-6及IL-10在免疫抑制效应中的作用。方法 原代分离脐带MSCs,并经流式细胞术鉴定。分选成年健康者和pSS患者外周血CD4⁺T细胞,分为对照组活化CD4⁺T细胞(CD3、CD28抗体共刺激72h)、MSCs共培养组(活化CD4⁺T细胞与MSCs共培养72h)和干扰素-γ(IFN-γ)预刺激后MSCs共培养组(活化CD4⁺T细胞与IFN-γ预刺激后的MSCs共培养72h),活化CD4⁺T细胞组为对照。ELISA法检测培养上清液中TGF-β1、IL-6、IL-10因子水平。结果 相对于活化CD4⁺T细胞组,MSCs共培养组培养上清中TGF-β1、IL-6、IL-10浓度均显著升高(P≤0.01),并且活化的CD4⁺T细胞增殖受到抑制。结论 MSCs通过促分泌TGF-β1、IL-6、IL-10抑制活化的CD4⁺T细胞增殖,起到免疫抑制作用。     

人乳牙牙髓干细胞对干燥综合征患者CD4+T细胞的免疫抑制效应

目的 探讨在体外人乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)及其联合IL-6抗体对干燥综合征患者(Sjgren syndrome, SS)外周血活化的CD4⁺T细胞的免疫抑制效应。方法 培养并鉴定SHED;流式细胞术检测健康者和SS患者外周血CD4⁺T细胞中Th1、Th2、Th17、Treg及Tfh的比例;将健康者和SS患者PBMC各自单独培养或与SHED共培养,ELISA法检测培养上清液中IL-6浓度,在各组中添加或不添加IL-6抗体,72h后流式细胞术检测CD4⁺T细胞增殖情况。结果 SS患者外周血CD4⁺T细胞中Th17及Tfh比例较健康者升高(P<0.05);健康者与SS患者共培养组的Th17比例显著降低(P<0.001),SS患者共培养组的Treg比例有所升高(P<0.05);在SS患者共培养组中添加IL-6抗体,可显著降低CD4⁺T细胞中Th2的比例(P<0.05)。结论 SHED可抑制SS患者CD4⁺T细胞的增殖,降低SS患者CD4⁺T细胞中Th17的比例且增加Treg的比例;IL-6抗体可降低与SHED共培养的SS患者PBMC中CD4⁺T细胞Th2亚型比例。     

CD90作为卵巢癌干细胞标志物的相关研究

目的 研究 CD90 作为分选卵巢癌干细胞标志物的可行性。方法 选择笔者实验室制备的人卵巢癌顺铂耐药细胞株 SKOV3-MD3,采用 CD90 单抗染色,应用流式细胞仪分选获得 CD90⁺ 细胞及 CD90-细胞。体外实验检测两个不同亚群细胞的体外悬浮球形成能力(自我更新能力)、分化潜能、表达干细胞标志物的差异,体内动物实验检测不同亚群细胞皮下成瘤能力是否有差异。结果 人卵巢癌细胞 SKOV3-MD3 中存在具有干性特征的 CD90⁺ 细胞,CD90⁺ 细胞比CD90- 细胞具有更高的体外悬浮球形成能力(自我更新能力)及分化潜能,表达更高水平的干细胞标志物,以及具有更强的皮下成瘤能力,差异有统计学意义。结论 CD90 可能是分选卵巢癌干细胞的分子学标志物。     

Breg Tfh Tfr细胞在免疫性血小板减少症患者中的表达及意义

目的 探讨调节性B细胞（Breg）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）、滤泡调节性T细胞（Tfr）在免疫性血小板减少症（ITP）中的作用和临床意义。方法 选择2017年10月至2019年10月安徽医科大学第一附属医院收治的初次诊断的30例ITP患者为ITP组,同期选择健康对照组25例,应用流式细胞术（FCM）检测外周血Breg、Tfh、Tfr细胞的表达水平并统计分析。结果 ITP组患者外周血CD19⁺B细胞中Breg[（1.93±1.21）%]、IL-10⁺Breg[（28.64±10.31）%]水平低于健康对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;外周血CD4⁺T细胞中Tfh细胞比例高于健康对照组[（12.18±5.26）% vs（6.21±1.78）%],Tfr细胞比例[（1.64±1.01）%]、Tfr/Tfh比值（0.21±0.13）低于健康对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 Breg细胞降低,IL-10分泌减少,Tfr/Tfh比值失衡,在ITP发病过程中可能起到重要的作用。     

免疫共刺激分子增强自噬小体疫苗诱导的T细胞应答

自噬小体疫苗DRibble被证实可以有效诱导小鼠和人T细胞应答,为了进一步增强DRibble疫苗诱导人T细胞应答的能力,本研究将免疫共刺激分子OX40、CD80和对照质粒分别转染至表达CMV pp65蛋白的LT3-pp65细胞系中,制备3种类型的DRibble疫苗为:Ctrl/pp65 DRibble、OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble。通过ELISA法检测不同DRibble疫苗诱导树突状细胞表达IL-12的水平,结果显示,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导树突状细胞表达IL-12的水平显著高于Ctrl/pp65 DRibble。进一步将3种DRibble疫苗分别刺激树突状细胞后与扩增的CMV特异性T细胞共培养,通过流式细胞术检测表达IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比。实验结果显示,与Ctrl/pp65 DRibble相比,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD8⁺ T细胞表达IFN-γ的能力显著增高,OX40/pp65 DRibble和CD80/pp65 DRibble诱导CD4⁺ T细胞表达IFN-γ的水平也显著高于Ctrl/pp65 DRibble。实验证明免疫共刺激分子OX40和CD80修饰均可以加强DRibble疫苗体外诱导人T细胞应答的能力。     

沙利度胺联合化疗对B细胞非霍奇金淋巴瘤免疫功能的影响

目的 研究沙利度胺联合奥沙利铂和吉西他滨化疗对复发难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B cell non-Hodgkin′s lymphoma,B-NHL)免疫功能的影响。方法 随机选取广西科技大学第二附属医院收治的复发难治性B-NHL患者,分为沙利度胺联合化疗组和单纯化疗组,同期健康者作为正常组,每组50例。采用流式细胞术检测外周血CD4⁺T、CD8⁺T、Treg、Th17细胞比率并计算CD4⁺/CD8⁺T和Treg/Th17细胞比例,ELISA法检测IL-17、IL-25含量。结果 与正常组比较,B-NHL患者治疗前外周血CD8⁺T、Treg、Treg/Th17细胞比例均明显升高,CD4⁺T、Th17、CD4⁺/CD8⁺T细胞比例及IL-17和IL-25水平均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);与治疗前比较,B-NHL患者治疗后CD4⁺T、CD4⁺/CD8⁺T、Th17细胞比例及IL-17和IL-25水平均明显升高,CD8⁺T、Treg和Treg/Th17细胞比例均明显降低,且沙利度胺联合化疗组的效果优于单纯化疗组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 沙利度胺联合奥沙利铂及吉西他滨治疗复发难治性B-NHL患者,可通过调节CD4⁺/CD8⁺T、Th17/Treg细胞比例及IL-17、IL-25水平进而改善患者免疫功能,且效果优于奥沙利铂联合吉西他滨化疗。     

PD-1在Graves病CD4+、CD8+T细胞中表达水平及作用机制

目的 探讨PD-1在Graves病CD4⁺、CD8⁺T细胞中表达水平,对甲状腺滤泡上皮细胞增殖及炎性细胞因子作用。方法 采用ELISA法检测GD患者和健康人血清炎性细胞因子水平。流式细胞仪检测外周血单个核细胞(PBMC)中CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞的百分率和T淋巴细胞中PD-1的表达。采用CCK-8、流式细胞仪和ELISA法检测CD4⁺PD-1⁺和CD8⁺PD-1⁺T细胞与甲状腺滤泡上皮细胞共培养后的存活率和炎性细胞因子的变化。结果 GD患者炎性细胞因子干扰素-γ、IL-4、IL-17和转化生长因子-β水平均升高(P<0.05)。GD患者CD4⁺T细胞百分率升高,CD8⁺T细胞百分率降低,CD4⁺和CD8⁺细胞PD-1表达均升高。在与CD4⁺PD-1⁺和CD8⁺PD-1⁺T细胞共培养的甲状腺滤泡上皮细胞中,细胞活力及上述炎性细胞因子最高。结论 GD患者CD4⁺、CD8⁺细胞中PD-1表达升高,可促进甲状腺滤泡上皮细胞活性,炎性细胞因子水平升高,可能加速GD的发生和发展。     

TJ-5抑制ubch5c介导NFMO泛素化调控NF-κB通路对MHD体内微炎症的影响

目的：通过观察倍半萜内酯化合物TJ-5调控 ubch5c介导NFMO泛素化对维持性血液透析( maintenance hemodialysis,MHD)患者体内微炎症的影响,探讨其通过调控NF-κB通路抑制MHD患者体内炎症因子表达的机制。方法：抽取MHD患者和正常人外周血。流式检测两组患者外周血中Th17/Treg比例;分别分离SLE患者和正常人外周血单一核细胞(PBMC),T细胞分选试剂盒分离纯化得到CD 4_⁺T细胞,并进行鉴定。分离得到的外周血CD 4_⁺T细胞使用不同浓度TJ-5处理,MHD患者分为：空白组(0μM/mL TJ-5处理)、高低浓度组(10、5μM /mL TJ-5处理)以及正常组(正常人)。LISA 法检测MHD患者外周血CD 4_⁺T细胞在TJ-5处理后TNF-a、IL- 1、IL-6及IL-10及因子的表达情况;Western Blot法检测SLE患者和正常人外周血CD 4_⁺T细胞P65、I-κB蛋白及其磷酸化;采用镍柱亲和纯化获得ubch5c,通过体外泛素化实验检测泛素连接酶ubch5c活性变化情况;免疫共沉淀法检测NEMO线性泛素化情况。结果：MHD患者外周血中Th17/Treg比例显著高于正常人(P<0.05);TJ-5处理后,CD 4_⁺T细胞促炎性因子TNF-a、IL- 1、IL-6明显下调,抗炎性因子IL-10明显上调(P<0.05);P65、I-κB蛋白及其磷酸化显著降低(P<0.05);ubch5c活性受到抑制(P<0.05);NEMO线性泛素化减弱(P<0.05)。结论：倍半萜内酯化合物TJ-5拮抗CD 4_⁺T细胞ubch5c活性,抑制NEMO线性泛素化调控NF-κB通路改善MHD体内微炎症。     

白细胞介素-33对肿瘤组织中髓系抑制性细胞功能的调控及机制

【目的】 CD11b⁺Gr-1⁺髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)具有强大的抑制T细胞的功能,是肿瘤微环境中介导肿瘤免疫逃逸和促进肿瘤发展的重要细胞亚群,但其功能调控的分子机制尚不清楚。本研究目的是揭示肿瘤组织中白细胞介素-33(interleukin 33,IL-33)对MDSC功能的调控作用及其机制。 【方法】 给BALB/c小鼠接种4T1细胞,构建小鼠乳腺癌模型;用免疫荧光、定量PCR、免疫组化和ELISA等方法检测小鼠4T1和人乳腺癌组织中IL-33的表达水平;流式细胞术检测野生型和IL-33受体ST2敲除小鼠(ST2^-/-)肿瘤组织中CD11b⁺Gr-1⁺MDSC的比例,以及MDSC增殖和凋亡的水平;检测IL-33处理前后MDSC存活水平,以及精氨酸酶-1(arginase 1,Arg-1)在mRNA水平以及酶活性上的变化;蛋白质印迹法检测IL-33处理后MDSC相关信号通路分子的改变,并用转录因子抑制剂进行验证,以揭示IL-33调控MDSC功能的关键转录因子。 【结果】 小鼠4T1和人乳腺癌组织中存在大量IL-33表达的现象;小鼠和人乳腺癌组织上清液中检测到高水平的IL-33。在小鼠肿瘤组织中,MDSC高表达ST2,其中45%的ST2⁺细胞为MDSC;ST2^-/-小鼠肿瘤组织中MDSC的数量比野生型显著减少(P<0.001);ST2^-/-小鼠肿瘤组织中的MDSC增殖显著减少,凋亡显著增多(P<0.05); 体外IL-33刺激能诱导MDSC增殖,减少凋亡;IL-33处理24 h后,Arg-1的mRNA表达及酶活性均显著增高(P<0.01)。IL-33处理后,MDSC的NF-κB和ERK的磷酸化水平明显增加,而加入转录因子抑制剂后,IL-33诱导MDSC上调Arg-1表达的效应显著降低(P<0.01),表明NF-κB和ERK对于IL-33调控MDSC的功能极其重要。 【结论】 证实肿瘤组织中高水平IL-33分泌可诱导MDSC增殖,促进其在肿瘤组织中的聚集,并上调MDSC表达Arg-1而增强其免疫抑制功能,NF-κB和ERK是IL-33作用于MDSC通路中至关重要的转录因子。研究结果为揭示肿瘤细胞免疫逃逸的机制提供了新的观点,并可能为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。     

UPLC-ELSD法同时测定重楼中重楼皂苷I、II、VI、VII

目的 建立同时测定重楼中重楼皂苷I、II、VI、VII的超高效液相色谱-蒸发光散射（UPLC-ELSD）分析方法。方法 采用Waters Acquity UPLC H-Class色谱系统,ELSD检测器,BEH C¹⁸色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）,流动相为乙腈-水,以体积流量0.45 mL/min进行梯度洗脱,柱温30 ℃。结果 被测成分在线性范围内均具有良好的线性关系（r＞0.999 5）;平均回收率在98.36%～100.11%,RSD≤1.56%。结论 UPLC法分离效果及重现性好,且快速、简便,可作为重楼的质量控制方法。     

葫芦科植物通用DNA条形码的筛选

目的 评价几个热点DNA条形码候选序列对葫芦科植物的鉴别能力。方法 使用ITS2、rbcL、matK和psbA-trnH序列的通用引物对葫芦科植物进行PCR扩增和测序,通过比较各序列的扩增和测序成功率、种内和种间的变异、barcoding gap,并采取相似性探索BLAST 1和最近距离Nearest Distance 方法评价不同序列的鉴别能力。结果 ITS2序列对葫芦科33个属、90个物种、182个样本进行分析,其鉴定成功率较高,在属水平为100.0%,在物种水平为88.5%;psbA-trnH序列对201个样本进行分析,其鉴定成功率在属水平为93.0%,在物种水平为73.1%,但其可以补充部分ITS2不能分析的物种区域。结论 ITS2和psbA-trnH是适合葫芦科植物鉴别的一个较好的DNA条形码序列组合。     

SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化状态在肝细胞癌预后评估的价值

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）1、长散在核元件（LINE）1基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌( 简称肝癌)临床病理参数的关系,及其在肝癌预后评估的意义。方法 收集105例肝癌患者血浆和50例对照健康人血浆DNA,使用甲基化特异性PCR（MSP）检测了SFRP1基因启动子区CpG岛高甲基化和LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化的情况;分析两种基因启动子甲基化和肝癌患者临床病理参数之间的关系;通过Kaplan-Meier曲线、对数秩检验及Cox多因素分析,分析SFRP1、LINE1基因甲基化状态与肝癌患者总生存率及无病生存率之间的关系。 结果 105例肝癌患者血浆中SFRP1基因启动子区CpG 岛高甲基化阳性率为59.05 % (62/105),LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化率为66.67%（70/105）,基因SFRP1高甲基化和LINE1低甲基化表达均阳性为43.81% (46/105),正常对照组中未发现有这两种基因甲基化;SFRP1高甲基化、LINE1低甲基化均与HBsAg是否阳性及甲胎蛋白（AFP）值相关(P<0.05);SFRP1、LINE1基因启动子区域的甲基化状态与总生存率及无病生存率有关：SFRP1高甲基化阴性+LINE1低甲基化阴性组患者预后最好,而SFRP1高甲基化阳性+LINE1低甲基化阳性组患者预后最差。结论 SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化与肝癌的发生、发展有一定联系,SFRP1和LINE1基因甲基化状态可以作为潜在可靠的分子标记物对患者预后进行预测。     

转双价抗虫基因 Bt-CpTI 提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性

目的 将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因 CryIA(c) 和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 CpTI 共同转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性。方法 构建了以 CaMV 35S 为启动子,新霉素磷酸转移酶 (Npt-Ⅱ) 为选择标记,带有 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因的植物表达载体 pGBI121S4ABC 并转入根癌农杆菌 LBA4404。采用叶盘法遗传转化四倍体菘蓝。转基因再生植株经 PCR 和 Southern 杂交检测,并进行抗小菜蛾实验。结果 T₀ 代转化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到 16.67%。Southern 杂交检测结果表明外源 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中。与野生对照相比,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性。结论 转双价抗虫基因 Bt-CpTI 是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段。     

不同栽培措施对两种天麻物候期及蒴果的影响

目的 对天麻Gastrodia elata物候期和蒴果进行研究,为克服天麻种性退化,培育优良种子,提供优质种源。方法 采用完全区组试验设计的方法,进行室内盆栽试验,分析了各栽培措施对两种天麻物候期和蒴果的影响。结果 从物候期看,3个种麻栽培时间中,12月栽培的红、绿天麻的现蕾期、开花期、结果期持续时间长（红天麻分别为12.50、9.80、7.25 d,绿天麻分别为12.80、10.75、7.00 d）,种子成熟时间短（红天麻为19.50 d,绿天麻为18.50 d）;3个种麻分级中,一、二级红、绿天麻的各物候期持续时间无显著差异（P＜0.05）。从蒴果上看,现蕾初期不打尖时,3个种麻栽培时间中,12月栽培的红、绿天麻蒴果质量好,红天麻蒴果数、蒴果质量和种子生命力分别为66.50个/株、28.18 g/株、87.88%;绿天麻蒴果数、蒴果质量和种子生命力分别为63.00个/株、20.09 g/株、78.40%;3个种麻分级中,一级红天麻的蒴果质量最好（蒴果数为96.29个/株,蒴果质量达50.21 g/株）,三级绿天麻的蒴果质量最差（蒴果数为40.00个/株,蒴果质量为14.90 g/株）。结论 在贵州西北地区,以一级红天麻,一、二级绿天麻作种,并于12月进行栽培,现蕾初期不采用打尖处理时,可以获得优质的天麻蒴果。     

紫苏及其变种的分子鉴定和亲缘关系研究

目的 构建紫苏属种、变种之间系统发育关系,准确鉴别紫苏Perilla frutescens var. arguta、白苏P. frutescens与其他变种。方法 提取紫苏、白苏及其他变种的DNA,对ITS和psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内（变种内）种间（变种间）Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离。采用最简约法（MP）和邻接法（NJ）构建分子系统树,进行系统发育和鉴定分析。结果 ITS和psbA-trnH MP系统树显示白苏和紫苏的不同地域的样本聚为一单系分支（支持率为100%和93%）,紫苏与回回苏构成姐妹群分支（支持率为95%和90%）,野生紫苏和耳齿紫苏构成一单系分支（支持率为100%和90%）;白苏、紫苏与其他变种间的ITS和psbA-trnH序列遗传距离0.008 21～0.018 18和0.002 38～0.029 31,明显大于白苏与紫苏间遗传距离0～0.001 65和0,大于各变种内遗传距离。结论 白苏和紫苏合并为一个种紫苏;紫苏与回回苏亲缘关系最近,野生紫苏与耳齿紫苏亲缘关系最近;ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别紫苏与其他变种。     

WNT信号通路相关基因多态性与急性白血病遗传易感性的相关性研究

目的 探讨WNT信号通路中β-链蛋白基因（CTNNB1）rs4135385位点、轴蛋白基因（AXIN2）rs11079571位点及分泌型卷曲相关蛋白基因(SFRP1)rs7832767位点多态性与急性白血病发病风险和治疗效果的关系,为个体化治疗提供依据。方法 对372例急性髓细胞白血病（AML）及急性淋巴细胞白血病（ALL）患者在治疗前抽取骨髓液1～1.5 mL, 401例健康对照（对照组）抽取静脉血2.0 mL,提取总DNA,用高分辨熔解曲线（HRM）方法进行CTNNB1 rs4135385、AXIN2 rs11079571、SFRP1 rs7832767基因分型,并通过卡方检验分析3个单核苷酸多态性（SNP）位点的基因型和等位基因频率分布在病例组和对照组中的差异,用单因素方差检验统计不同基因型患者的临床特征的差异,用卡方检验分析不同基因型患者诱导化疗完全缓解（CR）率的差异。结果 CTNNB1 rs4135385、SFRP1 rs7832767位点的基因型及等位基因频率分布在AML、ALL患者组与对照组中的差异均无统计学意义。AXIN2 rs11079571位点携带A等位基因的个体相对于G等位基因个体,发生急性粒单核/单核细胞白血病（AML-M4/5）的发病风险较低,差异有统计学意义（P=0.016,OR=0.677,95%CI:0.439~0.930）。此外,在AML-M 4/5患者中,AA基因型患者相对于AG和GG基因型患者有较高的血小板总数（P=0.040）,且诱导化疗CR率最高（P=0.040）。结论 在AML-M4/5中AXIN2 rs11079571位点的A等位基因频率低于正常对照组,并且携带A等位基因患者伴有较高外周血小板总数和诱导化疗敏感性。     

实验动物四种病原体多重PCR方法的建立与应用

目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Gen Bank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、支原体(266 bp)和肺炎克雷伯杆菌(142 bp)的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。     

KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制研究

目的 研究克雷伯菌属对亚胺培南耐药机制以及KPC-2基因在克雷伯菌属中传播机制。方法 收集四川大学华西医院两个阶段（2009～2010年和2012～2013年）分离的对亚胺培南耐药的克雷伯菌属细菌。琼脂稀释法测定亚胺培南最低抑菌浓度(MIC),CARB ChromID平板和改良Hodges试验检测碳青霉烯耐药表型,PCR检测细菌的KPC-2基因表达。质粒接合试验检测质粒传播性。随机引物扩增多态性DNA（RAPD）方法和肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）技术分别用于分析质粒和菌株的同源性。结果 第一阶段筛选并确证耐亚胺培南的3株产酸克雷伯菌首先获得碳青酶烯类抗生素耐药性,第二阶段筛选并确证耐亚胺培南的7株肺炎克雷伯菌出现相同的获得性耐药。PCR显示10株细菌均携带KPC-2型基因。质粒接合试验显示产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因的质粒可以传递到受体菌,且与KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌中携带的质粒具有同源性。ERIC-PCR结果显示7株KPC-2基因阳性的肺炎克雷伯菌具有同源性。结论 四川大学华西医院分离的对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌主要耐药机制是产生KPC-2型碳青霉烯酶。产酸克雷伯菌中携带KPC-2基因质粒,该质粒具有传递性且与肺炎克雷伯菌携带质粒相同。肺炎克雷伯菌中耐药株的传播形式为同一克隆传播,而在克雷伯菌属中不同菌种间耐药传播途径为同一质粒的水平传播。     

不同产地枳壳中柚皮苷和新橙皮苷的测定

目的 测定不同产地枳壳中柚皮苷和新橙皮苷的量,研究不同产地枳壳的质量差异。方法 采用高效液相色谱法测定,色谱条件为Kromasil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为乙腈-水（20∶80）（用磷酸调节pH值为3）;体积流量1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长283 nm。结果 朱栾枳壳未检出柚皮苷和新橙皮苷成分;江枳壳、川枳壳、湘枳壳和常山胡柚均检出柚皮苷和新橙皮苷成分;陕西枳壳未检出新橙皮苷。江枳壳含7.5%柚皮苷、5.6%新橙皮皮苷,量均为最高。结论 朱栾枳壳与其他产地枳壳的成分有差异,不含有《中国药典》2010年版规定的柚皮苷和新橙皮苷成分。