人Th17细胞体外诱导分化条件的研究

通过密度梯度离心法从人新鲜血液中分离获得人外周血单核细胞(PBMCs),比较分析加入不同细胞极化因子(IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-23)以及诱导不同时间(1,2,3,4 d)对Th17细胞分化的影响,利用流式细胞仪、ELISA方法以及Q-PCR技术考察相关指标,评估人体外Th17细胞的分化水平。研究表明,IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-23单独均能对Th17细胞的分化起到促进作用,联用IL-1β、IL-6、TGF-β和IL-23时可使Th17细胞体外分化效率达到最佳。随着诱导时间的延长,Th17细胞分化水平逐渐升高,培养3 d时达到峰值,继续增加培养时间分化率反而出现降低。最终确立人Th17细胞体外分化的最佳诱导条件:在加入CD3抗体和CD28抗体的基础上,同时加入IL-1β、IL-6、TGF-β以及IL-23共同培养人PBMCs 3 d可有效地刺激人Th17细胞的分化,并且流式细胞检测Th17细胞分化率达到近10%,ELISA检测细胞上清液中IL-17A含量达到近3 ng/mL,Q-PCR方法分析IL-17 mRNA基因表达升高达15倍,此方案具有操作简便、周期短、成本低廉等优点,为Th17细胞的功能研究及相关疾病治疗药物的研发建立了有效的检测平台。     

体外诱导兔骨髓单个核细胞向血管内皮细胞分化的研究

目的 :研究体外培养兔骨髓单个核细胞 (bonemarrowmononuclearcells,BM MNCs)诱导分化为内皮系细胞。方法 :穿刺抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心与免疫磁珠法富集的BM MNCs ,于内皮细胞条件培养基 (endothelialgrowthmedium ,EGM )中培养 2月 ,观察细胞的贴壁情况、形态变化及其血管内皮细胞特异性标志的表达。 结果 :培养第 3d开始出现梭形贴壁细胞 ,约第 7d出现团状聚集细胞集落 ;第 7～ 10d的贴壁细胞表达vWF、CD31,摄取acLDL ,分泌NO。贴壁细胞传代培养 10代后接近融合 ,细胞扩增了约 10 0 0倍。结论 :在一定条件下 ,体外培养BM MNCs可增殖诱导分化得到内皮系细胞。     

体外诱导人脐血单个核细胞向肝细胞样细胞的分化

目的:探讨人脐血单个核细胞（MNC）能否在体外诱导分化为肝细胞样细胞。方法:采集正常产妇脐血,淋巴细胞分离液分离MNC,流式细胞仪检测其表面标志。分别用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF4)、HGF+FGF4、无生长因子4种处理因素 进行诱导培养,于诱导前及诱导后的第7、14、21、28天采用RT-PCR检测AFP、白蛋白及C-met、FGFR₂ mRNA的表达,免疫细胞化学法检测肝细胞抗原和CK18的表达,PAS 法进行糖原染色。结果:诱导前检测到C-met、FGFR₂ mRNA的表达,诱导后第7和21天分别检测出AFP和白蛋白mRNA的表达,第28天检测出CK18、肝细胞抗原的表达及糖原染色阳性细胞,无生长因子诱导组未检测到肝系细胞标志。HGF+FGF4诱导组肝系细胞标志阳性率均高 于单独生长因子诱导组(P<0.05)。结论：HGF、FGF4均能在体外诱导人脐血MNC分化为肝细胞样细胞,且二者在一定程度上有联合作用。     

Tfh 细胞与临床疾病的研究进展

滤泡辅助性T细胞是近年来在研究中发现的一种比较特殊的辅助性T细胞（ Th细胞）。 Tfh细胞有明显区别于其他Th细胞亚群的特征性标志，但是其中最主要的标志物是CXCR5＋。 Tfh细胞主要的功能是通过产生IL-21，辅助B细胞产生抗体而间接参与适应免疫应答，从而对机体起到保护作用[1]。     

体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化的研究

目的　通过体外诱导骨髓基质细胞 (ＭＳＣ)研究其向心肌样细胞分化过程和心肌细胞特征表达情况。方法　抽取雄性ＳＤ大鼠骨髓 ,经分离培养和传代 ,获得较纯的ＭＳＣ ,体外连续传至第 8代 ,以去甲基化药物 - 5 -氮杂胞苷进行体外诱导 ,相差显微镜连续 8周观察其形态变化 ,通过流     

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

自1981年英国的Evans等和美国的Martini21相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来，胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前，已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞、血管和内皮等结构及细胞。利用胚胎干细胞体外诱导分化的成果可望发展出治疗多种疾病的新方法，将在人体早期发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。[第一段]     

干细胞样肝原始细胞的体外分化

目的：探讨干细胞样肝原始细胞集落体外分化的潜能。方法：分离孕13.5d的C57BL／6小鼠胎肝组织细胞并培养，第2天出现圆形成椭圆形干细胞肝原始细胞集落，随机挑取边界清楚的细胞集落分别培养，利用倒置相差显镜连续观察细胞生长过程中的形态学变化并用显微摄影记录结果，最后利用免疫细胞化学分析鉴定分化后细胞的性质。结果：干细胞样肝原始细胞集落在体外培养时可形成类似肝小叶的形状，集落中央大部分细胞分化成双核细胞，集落周边细胞仍为单核细胞，但体积明显增大，整个集中的细胞呈放射状排布。分化后，细胞群中的部分细胞表达成熟肝细胞标志白蛋白（albumin)，少部分细胞表达胆管上皮细胞标志细胞角蛋白19（cytokeratin19,CK19)，但所有细胞均不表达低分化肝细胞标志α－甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP)。结论：干细胞样肝原始细胞在体外具有我向分化能力，可分化为表达成熟肝细胞的胆管上皮细胞标志的细胞。     

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

自1981年英国的Evans等[1]和美国的Martin[2]相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来,胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前,已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心     

小鼠胎儿胸腺T细胞体外培养的分化和成熟

目的 观察BALB／c小鼠胎儿胸腺T细胞体外培养的分化和成熟。方法：采用小鼠胎儿胸腺器官体外培养体系及流式细胞术测其T细胞CD4、CD8和TCR的表达。结果：受孕15d胎鼠胸腺T细胞主要为CD4^－CD8^-细胞（96．0％）;体外培养3d后,大部分分化为CD4^ CD8^ 细胞（65．4％）,小部分成熟为CD4^ CD8^-(14.3%)和CD4^-CD8^ (11.2%)细胞;培养5d后,CD4^ CD8^ 细胞（59．7％）减少,而CD4^ CD8^-(14.3%)和CD4^-CD8^ (15.8%)增多;培养后10d,CD4^ CD8^ 细胞降低到47．2％,CD4^ CD8^-和CD4^-CD8^ 细胞分别增加到20．0％和24．9％,同时TCR明显表达。结论：应用小鼠胎儿胸腺器官培养体系进一步通过胸腺细胞的阳性和阴性选择证实其T细胞的分化和成熟过程。     

人骨髓基质细胞软骨诱导分化及其与细胞载体体外复合

目的：观察出生后入骨髓基质细胞（hBMSCs）在体外培养条件下增殖与分化的特点，探讨其向成软骨方向分化及机制。研究诱导细胞体外与PDLLA/壳聚糖多孔材料复合。方法：密度梯度离心法进行hBMSCs体外培养。应用传五代细胞，经化学限定培养基诱导细胞，设实验对照组。采用倒置显微镜观察细胞增殖及形态变化，甲苯胺蓝染色观察诱导细胞合成细胞外基质中的蛋白多糖，RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达。将诱导的细胞分别与多孔羟基磷灰石、PDLLA/壳聚糖多孔材料复合，应用扫描电镜观察其在细胞载体表面的生长情况。结果：传五代hBMSCs经化学限定培养基诱导后转化成圆形肥大细胞，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原mRNA表达与对照组比较有统计学意义。扫描电镜发现hBMSCs在PDLLA/壳聚糖多孔材料表面增殖良好并分泌大量细胞基质。结论：体外培养hBMSCs经化学限定培养基诱导后可向成软骨方向分化，可作为软骨组织工程种子细胞。PDLLA/壳聚糖多孔复合材料是组织工程良好的细胞载体，有利于细胞的黏附与增殖。     

黄芪通过促进滤泡辅助性T细胞活性抑制小鼠肾细胞癌生长

目的 探讨黄芪通过促进滤泡辅助性T细胞(Tfh细胞)活性抑制肾细胞癌生长的作用.方法 取56只BALB/c小鼠建立肾细胞癌模型,并随机平均分为黄芪治疗组和对照组.黄芪治疗组小鼠每天通过管饲法予0.5 mg/g黄芪提取物干预,对照组则每天给予相同体积的纯净水.两组建模后第0、9、12、15、18、21天分别处死3只小鼠,...     

SLE患者外周血滤泡辅助性T细胞的检测及其临床意义

目的 探讨滤泡辅助性T细胞(Tfh)在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血的比例及其临床意义.方法 收集60例SLE患者(SLE组)及60例健康体检者(对照组)外周血,采用流式细胞术方法检测CXCR5+ ICOS+的CD4+T细胞(即Tfh细胞)的比例,并分析Tfh细胞比例与患者疾病活动度及自身抗体的相关性.结果 SLE组患者外周血Tfh细胞比例明显高于对照组(t=5.830,P＜0.01),且SLE活动组明显高于SLE稳定组(t=7.313,P＜0.01),但狼疮肾炎组患者Tfh比例与无肾炎狼疮组比较,差异无统计学意义(t=0.986,P=0.328).SLE患者外周血Tfh细胞比例与疾病活动度、血清总IgG、抗核抗体滴度及抗ds-DNA均呈正相关(P＜0.05).结论 SLE患者外周血Tfh细胞的比例升高可能与患者疾病的发生及发展有关.     

氯胺酮对离体人辅助T细胞分化的影响

目的:探讨氯胺酮对离体人辅助性T(Th)细胞分化和细胞内转录因子T-bet及GATA3活性的影响?方法:10例男性健康志愿者(20~45岁,BMI 15~25 kg/m2),分别采集空腹时外周静脉血20 ml,分离外周血单核细胞(PBMCs)?每份血样的PBMCs均随机加入佛波醇-十四酸酯-乙酸酯(PMA)25 ng/ml和离子霉素1 ?滋g/ml以及各种浓度(0?50?100?200 ?滋mol/L)的氯胺酮孵育4 h?然后测量Th细胞亚群百分数?上清液中的干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)的水平以及细胞内转录因子T-bet和GATA3的DNA结合活性?结果:在PMA和离子霉素刺激下Th1和Th2细胞计数?IFN-γ和IL-4水平均显著增加;在PMA和离子霉素刺激下,氯胺酮剂量依赖性降低Th1和Th2细胞计数?IFN-γ和IL-4水平,而增加Th1?Th2细胞计数的比值(Th1/Th2)和IFN-γ?IL-4的比值(IFN-γ/IL-4);同样经刺激后,细胞内T-bet和GATA3的活性显著增加;氯胺酮剂量依赖性降低T-bet和GATA3的活性,而增加T-bet与GATA3活性的比值(T-bet/GATA3)?结论:在PMA和离子霉素的刺激下,氯胺酮能够抑制Th细胞的分化,从而抑制各细胞因子的分泌,但Th1/Th2增加;氯胺酮增加Th1/Th2可能与调节增加T-bet/GATA3有关?     

维生素D3对实验性自身免疫性甲状腺炎Th1/Th2细胞平衡和MCP-1/CCR2信号的影响

目的:探讨维生素D3对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠炎症、辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(helper T cell 1/helper T cell 2,Th1/Th2)及单核细胞趋化蛋白1/细胞表面趋化因子受体2(monocyte chemoattractant protein-1/cell surface chemokine receptor 2,MCP-1/CCR2)信号的影响.方法:将Lewis大鼠按随机数字表法分为对照组(n=10)、模型组(n=15)和治疗组(n=15),采用免疫猪甲状腺球蛋白(porcine thyroglobulin,pTG)诱导建立实验性自身免疫性甲状腺炎(experimental autoimmune thyroiditis,EAT)大鼠模型,治疗组按照每只5 mg/kg的剂量腹腔注射1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2D3],隔天1次,共用4周,其余2组均给予等体积生理盐水.采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin stain,HE)染色观察大鼠甲状腺组织形态学变化;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测血清中促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)、自身抗体抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibody,TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(anti-thyroid peroxidase antibody,TPOAb)及细胞因子干扰素-γ(interferon,IFN-γy)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、白细胞介素-4 (interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-10 (inter-leukin-10,IL-10),逐步线性回归分析TSH与自身抗体、细胞因子的关系;免疫组织化学检测甲状腺组织中的NF-κB p65;Western blot检测甲状腺组织中MCP-1/CCR2信号轴.结果:模型组甲状腺滤泡结构破坏、炎性细胞浸润,治疗组甲状腺病理变化明显改善并趋向于对照组.治疗组TSH、TGAb、TPOAb水平与模型组相比均明显降低(t=4.000、2.603、5.279,P=0.000、0.015、0.000),但仍明显高于对照组(t=2.400、2.216、7.392,P=0.025、0.037、0.000).与模型组相比,治疗组IL-4、IL-10水平明显升高(t=3.522、2.432,P=0.001、0.022),IFN-γ、IL-12水平及IFN-γ/IL-4、IL-12/IL-10比值明显降低(t=2.940、4.700、5.416、8.178,P=0.007、0.000、0.000、0.000),均趋向于对照组水平.逐步回归分析结果显示,TSH与TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-12均呈正相关,与IL-4和IL-10呈负相关(r=0.872、0.868、0.731、0.706、-0.557、-0.236,均P＜0.001),其中TGAb、TPOAb和IL-12对TSH的影响最明显.与模型组比较,治疗组大鼠甲状腺组织中的NF-κB p65、MCP-1及CCR2水平均下降,差异具有统计学意义(t=2.432、2.267、5.143,P=0.000、0.031、0.000).结论:维生素D3可能是通过抑制NF-κB通路以下调Th1型细胞因子、上调Th2型细胞因子进而降低Th1/Th2比值,还可能是通过抑制MCP-1/CCR2信号轴,最终减轻EAT大鼠甲状腺炎,改善甲状腺功能,抑制甲状腺抗体生成,保护甲状腺.     

类风湿关节炎患者外周血滤泡辅助性T淋巴细胞百分率的变化及意义

目的 探讨滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)百分率在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的变化及意义.方法 选取该院2016年9-11月收治的RA患者,分为RA活动组与RA稳定组,各35例.另选取同期行健康体检者35例作为健康对照组.用流式细胞术检测受试者外周血CD4+ CXCR5+ ICOS+ Tfh细胞的百分率,分析RA患者外周血Tfh细胞百分率与28个关节疾病活动度评分(DAS28)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体及类风湿因子(RF)水平的相关性.结果 RA活动组外周血Tfh细胞百分率[(0.84±0.16)％]明显高于RA稳定组[(0.64±0.15)％]及健康对照组[(0.56±0.14)％],差异均有统计学意义(P＜0.01);且RA稳定组亦高于健康对照组(P＜0.05).RA患者外周血Tfh细胞百分率与DAS28及抗CCP抗体水平均呈明显正相关(r=0.355、0.324,P＜0.01),与RF水平无明显相关性(r=0.205,P＞0.05).结论 外周血中Tfh细胞百分率的增加可能与RA的发生、发展有关.     

氯胺酮对人离体Th细胞分化功能的影响

目的观察不同浓度氯胺酮对人离体辅助性T淋巴细胞（Th细胞）分化功能的影响。方法采15例ASAI级择期手术患者外周静脉血,分为对照组（c组）,和氯胺酮1、2、3组（K1、K2、K3组）,氯胺酮1～3组终浓度分别为1、3、30μg／ml。采用三色免疫荧光标记和流式细胞术检测各组全血中T细胞内干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的表达,推算出全血中Thl细胞及Th2细胞百分率,并计算Th1细胞与Th2细胞的比值（Th1／Th2）。结果不同浓度氯胺酮对Th细胞的分化无显著影响。结论氯胺酮不增强围手术期的免疫抑制效应。     

滤泡辅助性T细胞与自身免疫性疾病的研究进展

滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells,Tfh细胞）是新近被命名的负责辅助B细胞产生抗体的新的CD4＋T细胞亚群,其主要功能是帮助B细胞激活、增生和分化,以形成生发中心。趋化因子受体5（C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5）、诱导性共刺激分子（inducible co-stimulator,ICOS）、白介素21（interleukin 21,IL-21）、B细胞淋巴瘤因子6（B-cell CLL/lymphoma 6,Bcl-6）等主要功能分子参与了Tfh细胞的分化。Tfh细胞数量以及其效应功能分子异常与多种自身抗体介导的自身免疫性疾病相关。     

初发Graves病患者外周血调节性T细胞及滤泡调节性T细胞检测的临床研究

目的：　检测Graves病（Graves'' disease,GD）患者外周血调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）、滤泡调节性T细胞（follicular regulatory T cells,Tfrs）、滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells,Tfhs）数量及其表面分子肿瘤坏死因子受体超家族成员4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4,OX40）、程序性死亡因子1（programmed-death 1,PD-1）的表达。方法：　纳入初发GD患者23例（GD组）和健康对照者22例（NC组）,通过流式细胞术检测2组外周血Tregs（CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）、Tfrs（CD4⁺Foxp3⁺PD-1⁺CXCR5⁺）及Tfhs（CD4⁺Foxp3^-PD-1⁺CXCR5⁺）细胞比例及其表面分子OX40、PD-1表达,分析GD发病与Tregs、Tfrs、Tfhs及其OX40、PD-1表达的关系,同时分析各检测指标与临床指标的相关性,初步探讨其临床意义。结果：　与NC组相比,GD组Tregs数量明显升高,Tregs上PD-1表达降低,Tregs上PD-1表达与TRAb水平呈显著负相关;初发GD患者Tfrs数量明显降低,且Tfrs上OX40表达上调,Tfrs数量与TRAb呈显著负相关。结论：　PD-1在Tregs上的低表达可能通过影响Tregs功能参与GD发病,GD患者体内Tfrs数量明显减少,且其OX40表达明显升高,OX40可能通过影响Tfrs与Tfhs稳态参与GD发病,这为临床上关于GD的治疗提供了新思路。     

滤泡辅助性T细胞在免疫性血小板减少症发病机制中的作用

目的 探讨免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患者外周血B细胞、成熟B细胞、滤泡辅助性T细胞及树突状细胞亚群的变化,及其相互关系及Tfh细胞在ITP发病中的作用.方法 采用流式细胞术检测35例初治ITP患者及30例正常人外周血B细胞及成熟B细胞比例、Tfh细胞数量及树突细胞亚群.结果 ITP患者外周血CD19+B细胞及成熟B细胞比例分别为(13.49±9.05)％和(81.96±11.99)％,均高于对照组[(9.12±4.60)％和(75.42±12.86)％,P＜0.05].ITP患者Tfh细胞(CD4+CXCR5+ICOS+PD-1+)比例为(4.27±3.88)％,明显高于对照组(1.02±0.54)％,差异有统计学意义(P＜0.01).ITP患者浆细胞树突细胞比例为(2.06±1.65)％,明显低于对照组(5.07±3.48)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 ITP患者存在Tfh细胞数量异常,可能导致B细胞比例升高,在ITP的发病机制中起重要作用.