GCF低表达宫颈癌HeLa细胞系的构建及辐射对其调控IER5基因表达的初步探究

目的 构建GCF低表达的宫颈癌HeLa细胞系,在⁶⁰Co γ射线照射下初步探究其细胞增殖以及调控宫颈癌放射敏感基因IER5的表达。 方法 经带有荧光标记的GCF低表达的质粒稳定转染HeLa细胞, G418筛选,蛋白印迹法、实时定量PCR法鉴定得到GCF-shRNA-HeLa单克隆细胞系。倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8法探究不同剂量照射后的细胞增殖情况,在不同照射剂量下用蛋白印迹法检测GCF-shRNA-HeLa及对照细胞中IER5蛋白的表达情况。 结果 成功构建稳定表达的GCF-shRNA-HeLa单克隆细胞系,显微镜下观察GCF-shRNA-HeLa细胞比正常HeLa细胞体积小,细胞间隙较大,其中梭形细胞较多。蛋白印迹法及实时定量PCR验证了GCF-shRNA-HeLa的蛋白表达及mRNA转录水平均低于对照组(P<0.05)。辐射情况下实验结果显示在同一照射剂量、同一时间下GCF-shRNA-HeLa细胞比control对照细胞增殖缓慢(P=0.014)。不同剂量照射情况下蛋白印迹法检测HeLa细胞、control-shRNA-HeLa与GCF-shRNA-HeLa细胞IER5蛋白表达情况,结果同一辐照剂量下GCF沉默的细胞系中IER5的表达量比对照细胞高, 4Gy照射的GCF-shRNA-HeLa的IER5表达量最高(P<0.05)。 结论 本实验构建了低表达GCF的HeLa细胞系,初步探讨GCF作为IER5基因抑制性转录因子的作用。结合临床基因靶向治疗,可寻求可以降低GCF表达的方式,通过上调IER5表达这一双效途径来加速宫颈癌细胞凋亡。     

MicroRNA-31-3p靶向调控Sema4C表达对宫颈癌顺铂耐药性的作用及其机制研究

目的 探讨人宫颈癌细胞microRNA-31-3p（miR-31-3p）的表达及其靶向调控Sema4C表达对顺铂耐药性的作用机制研究。方法 取对数生长期Hela细胞,分别转染miR-31-3p mimics（miR-31-3p mimics组）、空白质粒（对照组）,以及在转染miR-31-3p mimics的基础上过表达Sema4C（miR-31-3p mimics＋Sema4C组）。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-31-3p的表达,Western blotting检测转染mimics后Hela细胞Sema4C蛋白的表达,CCK-8法检测不同浓度顺铂作用下Hela细胞的耐药性变化。结果 miR-31-3p在宫颈癌细胞Hela中低表达（P <0.05）。miR-31-3p mimics组、miR-31-3p mimics+Sema4C组miR-31-3p相对表达量高于对照组（P <0.05）,且miR-31-3p mimics组与miR-31-3p mimics+Sema4C组miR-31-3p相对表达量比较,差异无统计学意义（P >0.05）。miR-31-3p mimics组、miR-31-3p mimics+Sema4C组Sema4C蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）;miR-31-3p mimics+Sema4C组Sema4C蛋白相对表达量高于miR-31-3p mimics组（P <0.05）。不同浓度顺铂作用下,miR-31-3p mimics组Hela细胞生存率均低于对照组（P <0.05）;2 μmol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L顺铂作用下,miR-31-3p mimics+Sema4C组Hela细胞生存率高于miR-31-3p mimics组（P <0.05）。结论 miR-31-3p靶向调控Sema4C表达,降低宫颈癌细胞对顺铂的耐药性。     

RNAi沉默polβ基因部分逆转食管鳞癌细胞顺铂耐药性

目的 通过RNA干扰（RNAi）技术沉默DNA聚合酶polβ的表达,观察其对食管癌细胞顺铂（cDDP）耐药性的影响。方法 构建靶向polβ基因的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2及阴性对照载体pRNAT-U6.2/Lenti-polβC,将其感染人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706/cDDP,通过RT-PCR、蛋白质印迹分析和免疫荧光实验观察细胞polβ的表达情况,采用MTT法观察不同浓度顺铂对细胞生长的抑制作用并计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度（IC₅₀）和耐药指数（RI）。结果 靶向polβ的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1和pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2感染EC9706/cDDP后均可下调polβ的mRNA和蛋白表达水平,其中前者效果更为显著。顺铂以剂量依赖方式抑制EC9706/cDDP细胞增殖,感染pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβC的EC9706/cDDP细胞及未感染EC9706/cDDP细胞对顺铂的IC₅₀分别为55.71、62.41、63.11 μg/mL,耐药指数分别为13.9、15.5、15.7,其中前者与后二者相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论 polβ的表达与食管鳞癌细胞系EC9706/cDDP顺铂耐药性有关,沉默其表达可部分逆转EC9706/cDDP细胞对顺铂的耐药性。     

吉马酮调节FAK/YAP信号通路对非小细胞肺癌细胞顺铂耐药性的影响

目的 探讨吉马酮(GMC)调节局部黏着斑激酶(FAK)/Yes相关蛋白(YAP)通路对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞顺铂(DDP)耐药性的影响。方法 将A549/DDP细胞分为CK组、低剂量GMC组(GMC-L组,5μmol/L)、中剂量GMC组(GMC-M组,10μmol/L)、高剂量GMC组(GMC-H组,20μmol/L)、GMC-H+pcDNA组(20μmol/L+转染pcDNA)、GMC-H+pcDNA-FAK组(20μmol/L+转染pcDNA-FAK)。检测各组细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况;检测多药耐药基因1(MDR1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、磷酸化的FAK(p-FAK)、YAP蛋白表达情况。结果 与CK组比较,GMC-L组、GMCM组、GMC-H组A549/DDP细胞OD450值、克隆形成率、划痕愈合率、侵袭细胞数、MDR1、PCNA、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、p-FAK蛋白及核YAP蛋白表达降低,细胞凋亡率升高,且呈浓度依赖性(P<0.05);与GMC-H组、GMC-H+pcDNA组比较,GMC-H+pcDNA-FAK组A549/DDP细胞OD₄₅₀值、克隆形成率、划痕愈合率、侵袭细胞数、MDR1、PCNA、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、p-FAK蛋白及核YAP蛋白表达升高,细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论 GMC可能通过抑制FAK/YAP信号通路减弱NSCLC细胞DDP耐药性。     

顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和凋亡

目的：探讨顺铂对HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2蛋白表达及核转位的影响,并观察细胞自噬和凋亡的变化。方法：使用不同浓度的顺铂(0、2.5、5、10μmol/L)干预HeLa人宫颈癌细胞,MTT法检测细胞活性,Transwell实验观察细胞迁移能力,mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒转染HeLa细胞观察自噬水平的变化,流式细胞术检测细胞凋亡水平,免疫蛋白印迹检测Nrf2在细胞质和细胞核内的表达情况,免疫荧光法观察Nrf2的核转位情况。结果：与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可抑制HeLa细胞的活性及细胞迁移能力(P<0.05),且随着药物浓度增高抑制作用增强(P<0.05)。与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可促进HeLa细胞中LC3B的表达、细胞凋亡及Nrf2的核转位(P<0.05),降低细胞质中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05),并升高细胞核中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05)。结论：顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和细胞凋亡,并抑制细胞的活性和迁移能力。     

白杨素增强辐射诱导宫颈癌 HeLa 细胞系球形成细胞凋亡

目的：研究白杨素对宫颈癌 HeLa 细胞系球形成细胞（SFCs）放疗增敏作用。方法：干细胞条件培养基悬浮培养得到人宫颈癌 HeLa 细胞系 SFCs。DNA/组蛋白酶联免疫吸附试验（ELISA）检测辐射诱导 SFCs 和亲本细胞凋亡作用。Western blot 分析 SFCs 和亲本细胞 p-STAT3蛋白表达。结果：与亲本细胞相比,HeLa 细胞系 SFCs耐受细胞凋亡。20.0μmol/L 白杨素增强辐射诱导 SFCs 凋亡作用。20.0μmol/L 白杨素降低 SFCs STAT3磷酸化水平。结论：白杨素增强辐射诱导人宫颈癌 HeLa 细胞系 SFCs 凋亡作用与其抑制 STAT3活性相关。     

血红素加氧酶-1的表达对氟尿嘧啶诱导食管癌细胞凋亡的影响

目的 本研究探讨血红素加氧酶-1与氟尿嘧啶诱导食管癌细胞凋亡的关系。 方法 培养ECa109食管鳞癌细胞,实验组分别加入正常培养基,含20μmol/L、80μmol/L锌原卟啉(ZnppIX)的培养基培养12h,后更换为含100μg/ml 5-FU组培养;对照组予正常培养基培养;共培养96h后检测各组细胞凋亡情况。 结果 在凋亡早期细胞中(Annexin V⁺/PI^-),20μmol/L ZnppIX组(25.63%±6.52%)及80μmol/L ZnppIX(22.48%±5.59%)组显著高于5-FU组(12.89%±4.42%,P均<0.05)。在中晚期凋亡细胞(Annexin V⁺/PI⁺)中,20μmol/L ZnppIX组(25.17%±5.53%)显著低于5-FU组(39.89%±6.66%)及80μmol/L ZnppIX组(41.95%±2.92%,P均<0.01)。80μmol/L ZnppIX组caspase-3的活化率显著高于正常细胞(P<0.05)。 结论 ZnppIX抑制HO-1表达后,可以显著增加5-FU诱导的Eca109食管癌细胞凋亡率,caspase-3参与了其诱导细胞凋亡的过程。     

番茄红素对人骨肉瘤细胞顺铂增敏作用及机制研究

目的 研究番茄红素（lycopene,LP）对人骨肉瘤MG-63细胞顺铂化疗敏感度的影响并初步探讨其可能的作用机制。方法 体外培养并取对数生长期人骨肉瘤MG-63细胞,设空白对照组、LP组（10μg/ml）、顺铂组（40μg/ml）和联合组[LP（10μg/ml）+顺铂（20μg/ml）];药物干预48h后,采用噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测细胞周期和细胞凋亡状况,反转录PCR（RT-PCR）法检测Bax mRNA、bcl-2 mRNA表达并计算Bax/bcl-2比值,蛋白免疫印迹（Western blot）法检测caspase-3蛋白表达。结果 联合干预组与顺铂组比较发现,联合干预组人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率显著升高（P<0.05）,细胞周期G₀/G₁期显著延长（P<0.05）、S期和G₂/M期显著缩短（P<0.05,P<0.01）,细胞凋亡率（apoptosis index,AI）显著升高（P<0.01）,Bax mRNA表达明显上调、bcl-2 mRNA表达显著下调（P<0.05）且Bax/bcl-2比值显著升高（P<0.01）,caspase-3蛋白表达上调（P<0.01）。LP组与空白对照组比较发现,LP组MG-63细胞周期明显改变（G₀/G₁期延长、G₂/M期缩短）,bcl-2 mRNA显表达著下调（P<0.05）、Bax/bcl-2比值显著升高（P<0.05）,caspase-3蛋白表达显著上调（P<0.01）。结论 LP具有提高人骨肉瘤MG-63细胞顺铂敏感度的药理学作用,其机制可能与LP能够阻滞细胞周期以及调节凋亡相关调控基因和蛋白表达有关。     

苦豆碱对膀胱癌EJ细胞增殖与凋亡的影响

目的 观察苦豆碱对膀胱癌EJ细胞增殖与凋亡的影响并探讨其作用机制。方法 实验分组如下,A组：膀胱癌EJ细胞不作处理;B组：加入苦豆碱浓度25μmol/L;C组：加入苦豆碱浓度50μmol/L;D组：加入苦豆碱浓度100μmol/L。通过CCK8检测各组细胞的存活率,通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率,通过Western blot法检测各组细胞Bcl-2、Bax、p-Erk1/2蛋白的表达水平。结果 CCK8结果显示,B、C、D组较A组细胞存活率降低（P<0.05）;流式细胞术结果显示：B、C、D组较A组细胞凋亡率增加（P<0.05）;Western blot结果显示：B、C、D组较A组Bcl-2、p-Erk1/2表达水平降低（P<0.05）,Bax表达水平增高（P<0.05）。结论 苦豆碱可降低膀胱癌EJ的存活率,诱导其凋亡,其作用机制可能是通过抑制Erk1/2的磷酸化而实现的。     

花旗松素通过PI3K/AKT/mTOR通路对宫颈癌SiHa细胞自噬、凋亡和衰老的影响

[目的] 观察花旗松素（Taxifolin）对宫颈癌SiHa细胞自噬,凋亡和衰老的影响。[方法] 采用0、5、10、20μmol/LTaxifolin处理宫颈癌SiHa细胞。CCK-8法检测细胞细胞增殖倍数;蛋白免疫印迹检测Beclin1、p62、LC3II/LC3I蛋白表达水平;免疫荧光检测LC3+含量;流式细胞仪检测细胞凋亡;流式分选检测线粒体膜电位;蛋白免疫印迹检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、cleavedCaspase-3、Caspase-9、cleavedCaspase-9、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、pPI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR蛋白表达水平,加入AKT激活剂SC79进行验证。[结果] 与Taxifolin0μmol/L组相比较,Taxifolin10、20μmol/L组细胞增殖倍数显著降低（P<0.05）,p62蛋白水平显著降低（P<0.05）,Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平显著升高（P<0.05）,LC3+含量显著升高（P<0.05）,凋亡率显著升高（P<0.05）,线粒体膜电位显著升高（P<0.05）,Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.05）,cleavedCaspase-3/Caspase-3、cleavedCaspase-9/Caspase-9比值升高（P<0.05）,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值显著降低（P<0.05）。加入PI3K/AKT信号通路激活剂SC79可逆转花旗松素对SiHa细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。[结论] Taxifolin通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化诱导宫颈癌SiHa细胞自噬,凋亡和衰老。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。