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相似文献
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1.
【目的】构建ZFP580基因的原核表达质粒,转化大肠杆菌,诱导表达并分离纯化大鼠锌指蛋白ZFP580。【方法】根据ZFP580 cDNA序列的开放阅读框设计引物,利用PCR技术扩增ZFP580的开放阅读框cDNA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,Nco I、Xho I双酶切电泳筛选、鉴定并测序。将构建的重组质粒pET30a-ZFP580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白。【结果】成功扩增ZFP580基因并构建了表达质粒pET30a-ZFP580,测序结果表明与GeneBank公布的序列一致。含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa。【结论】成功表达并纯化了大鼠ZFP580蛋白,为进一步研究锌指蛋白ZFP580的功能奠定了基础。  相似文献   

2.
目的对分支杆菌的一种分泌蛋白Ag85B的基因进行克隆、表达,为结核病进行诊断打下基础。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,以PCR法对基因ag85b进行扩增,产物与载体质粒pET24b构建表达Ag85B的重组质粒,将此重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内,抽提质粒,酶切检验,再转化入表达宿主大肠杆菌JM109(DE3)菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-  相似文献   

3.
目的 构建可溶性DC-SIGN(sDC-SIGN)原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白.方法 采用PCR方法,从含人DC-SIGN cDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coli BL21 (DE3)诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose 4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1 300 bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符.纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38 000,Western bolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合.结论 获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础.  相似文献   

4.
利用TA克隆载体构建pET15b-SOD1重组质粒   总被引:23,自引:9,他引:14  
  相似文献   

5.
目的 应用基因重组技术,构建pET30a(+)与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a(+)载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta (DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni+-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a(+)与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.  相似文献   

6.
目的获得大鼠肝脏F蛋白基因克隆(F-protein’s cDNA);利用原核(大肠杆菌)表达系统表达大鼠肝脏F蛋白。方法提取大鼠肝脏总RNA,对其进行反转录和PCR(RT-PCR)扩增出目的基因(F-protein’s cDNA),然后将其与pUCm-T载体进行连接获得克隆质粒pUCm-T-F并转化到大肠杆菌DH5α中;将测序结果正确的克隆片断重新与表达载体pET-15b连接,获得F抗原表达质粒pET15b-F并将其转化到表达菌株BL21(DE3)pLysS中,用1mmol/L IPTG诱导其表达。结果RT-PCR扩增出的目的基因(F-protein’s cDNA),经测序证明与Gene-bank上提供的F蛋白cDNA序列完全一致;表达后的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,目的蛋白分子量大小约为43 kD,与预期值相符,表达量可达全菌总蛋白量的40%。结论表达的目的蛋白经His-tag柱进行亲和层析纯化,SDS-PAGE检测得到了不含其他杂蛋白的单一F蛋白条带,与豚鼠抗人F蛋白抗血清反应成阳性,说明我们经基因工程方法得到的纯化的F蛋白有免疫活性。  相似文献   

7.
目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3'末端加“A”并纯化.然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶(Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1.CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U/g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。  相似文献   

8.
目的:探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin (TgPRF)的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法:以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a (+)载体中。重组的pET28a (+)-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果:PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白(纯度>90%)。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论:成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。  相似文献   

9.
目的:利用大肠杆菌表达酿酒酵母无机焦磷酸酶(Y-IPPA),获得具有活性的酿酒Y-IPPA。方法:以酿酒酵母基因组为模版,通过查询NCBI获得酿酒酵母无机焦磷酸酶序列,设计引物,用PCR方法获得酿酒Y-IPPA基因序列,插入克隆性载体pMD19-T Simple Vector中,并转化至大肠杆菌DH5α扩增,获得重组质粒,经酶切及测序验证正确后,将酶切的目的片段插入到原核表达载体p ET28(a)中,再转化大肠杆菌DH5α扩增,经酶切及测序验证正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达蛋白,通过IPTG诱导表达出Y-IPPA,以金属离子亲和层析蛋白纯化系统纯化蛋白,并测定其比活和酶学性质。结果:获得与pMD19-T Simple Vector一致的Y-IPPA碱基序列,构建了重组表达质粒pET28(a)-Y-IPPA,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导并进行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为32 000处可见Y-IPPA蛋白条带;镍柱亲和层析纯化目的蛋白,其中一组的蛋白浓度、活性和比活分别为0.312 g.L-1、31.13 units.mL-1和99.73 uints.mg-1。结论:成功制备Y-IPPA蛋白,为进一步研究其酶学性质奠定了基础。  相似文献   

10.
[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。  相似文献   

11.
利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒   总被引:8,自引:5,他引:3  
目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。  相似文献   

12.
目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。  相似文献   

13.
目的:构建融合蛋白PEP-1-p27mt的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自pORF9-hp27mtv21质粒中扩增p27mt基因,克隆入中间载体pGEM-TEasy Vector。经XhoI和BamH1双酶切后,构建原核表达载体pET15b-pep-1-p27mt,经测序证实构建成功后转化EcoliBL21(DE3)pLysS,表达PEP-1-p27mt融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲合层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了相对分子量为32×103的PEP-1-p27mt融合蛋白。结论:PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础。  相似文献   

14.
目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白。方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。将纯化的人CAT cDNAPCR产物与经XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析。结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT。SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。  相似文献   

15.
目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...  相似文献   

16.
目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,在大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2+-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,纯化后的蛋白浓度为6.18mg/ml,蛋白产量为14.15mg/100ml菌液,SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP,细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。  相似文献   

17.
胡宏平  赵群益  戴金华  朱亚芬 《浙江医学》2009,31(5):604-605,717
目的构建抗菌肽-23与3型碳水化合物结合分子(CBM3)融合蛋白的原核表达载体并进行诱导表达、纯化和鉴定。方法PCR扩增PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,产物经酶切、纯化、回收后与经同样双酶切并回收后的pET21a原核表达载体相连接,连接产物转化感受态DH5α菌,经菌落PCR筛选出阳性菌落并提取质粒进行初步酶切鉴定后进一步行双向测序鉴定,插入序列完全正确者命名为pET21a-PMAP-23-LK-CBM3重组载体,并将其转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG诱导PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白表达后提取菌体蛋白行亲和层析纯化,并对纯化产物进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot鉴定。结果成功构建了pET21a-PMAP-23-LK-CBM3融合重组质粒,成功诱导、纯化并鉴定出PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,分子量与理论值相符。结论成功表达并纯化、鉴定出了PMAP-23-LK-CBM3融合蛋白,为进一步将其应用于抗菌机制和药理实验的研究奠定了基础。  相似文献   

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