获取SD仔鼠角朊细胞和真皮成纤维细胞6种方法比较

目的 :探讨如何以简便快捷的方法获得大量最佳生长状态的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞 .方法 :用 2 .5 g·L -1 胰酶、35 g·L -1 热溶素和 9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase分别在不同条件下处理皮肤标本 ,观察表皮与真皮的分离情况 ,并分别培养角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,观察比较细胞的贴壁率和克隆形成率 ,通过MTT和BrdU检测观察细胞的生长状态 ,并分别用不同方法获得的细胞构建组织工程皮肤 .结果 :在各种条件下 ,Dispase处理组获得的细胞数量、细胞贴壁率和克隆形成率均优于其他消化液处理组 ,细胞纯度高 ,生长状态良好 ;用其他方法获得的细胞生长状态相似 ,都可成功构建组织工程皮肤 .结论 :使用9.0× 1 0 3 U·L-1 Dispase可以简便快捷的获得大量生长状态良好的角朊细胞和真皮成纤维细胞 ,以作为皮肤组织工程的种子细胞 ,合适的消化方法、时间和温度可以最大限度保持原代细胞的活力     

人表皮角质形成细胞的体外改良培养

目的:探讨人表皮角质形成细胞的体外改良培养方法。方法:取皮肤标本,先用 2. 5g/L胰蛋白酶 4℃浸泡 22h(冷消化法),以便于表皮真皮分离;分离后刮除真皮面 (真皮刮除法 )以获取基底细胞;收集表皮及基底细胞并混合,制成细胞悬液进行培养。培养至第 5d,采用人工纯化法去除成纤维细胞。其他操作同人表皮细胞常规培养法。培养结束后,以台盼蓝染色法检测细胞存活率,观察细胞生长状态,并与传统培养方法相比较。实验重复 3次。结果:改良组 3次培养细胞存活率分别为 87%, 91%和 95%,均高于对照组 ( 82%, 82%和 85% ) (P<0. 05)。改良组生长速度亦较快。结论:采用人工纯化法、冷消化法和真皮刮除法等改良方法可提高体外培养的人表皮角质细胞存活率及生长速度。     

含转表皮细胞生长因子基因人表皮细胞复合皮的构建与移植

目的探讨转染表皮细胞生长因子(EGF)基因的人表皮细胞移植后EGF的表达及对细胞增殖的影响。方法将Balb/c小鼠的表皮细胞和转染EGF基因的人表皮细胞按1∶1、1∶3、1∶5的比例混合,种植于脱细胞真皮替代物表面,于体外培养后形成复合皮,将复合皮移植于Balb/c小鼠全层皮肤缺损创面,抗EGF抗体免疫组织化学染色观察移植后EGF的表达,抗增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察表皮细胞的增殖情况。结果小鼠表皮细胞与转EGF基因的人表皮细胞按1∶5混合构建的复合皮移植后1～2周,抗EGF染色阳性,1周时,新生表皮基底层中PCNA阳性细胞比含单纯小鼠表皮细胞的复合皮移植后显著增多(P<0.01)。结论转染EGF基因的人表皮细胞在移植后早期可表达外源基因产物,并促进表皮细胞增殖。     

以组织工程技术构建活性双层人工皮肤

用冷冻干燥胶原凝胶方法制备胶原海绵,经戊二醛交联处理,作为活性双层人工皮肤的支架;以幼儿包皮为细胞来源获得真皮成纤维细胞和皮肤角质细胞,体外扩增后作为种子细胞;在胶原海绵上接种成纤维细胞和角质细胞,体外构建活性双层人工皮肤。研究结果表明,人工真皮内的成纤维细胞生长良好,并且有人纤粘连蛋白类生物活性物质存在,活性双层人工皮肤表皮层有类似干天然皮肤表皮层的组织结构。     

人角质形成细胞体外分离与无血清培养的实验研究

目的探讨一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法,为角质细胞的多方面研究提供细胞来源。方法采取两步消化法对皮肤进行消化以获取角质形成细胞,采用无血清培养技术进行角质细胞的体外培养,进行细胞形态学观察以及生长曲线的绘制与分析。结果分离酶和胰蛋白酶联合两步消化法能够很好地分离表皮与真皮,活细胞率高,培养后细胞融合时间短,同时又能够避免成纤维细胞的污染,可获取较多高纯度的角质形成细胞。角质细胞无血清培养可以在体外快速稳定增殖,并在多次传代后保持了正常形态。结论两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

Studies on the Cultivation and Transplantation.of Epidermal Cells:Growth of Cultured Human Epidermal Keratinocytes in Three Culture Models

The growth of 111 cultures of human epidermal keratinocytes inexplant culture,dispersed cell culture and 3T3 feeder layer culturewas studied.The rate of monolayer formation was 80.0% in 3T3feeder layer cultures,52.5% in explant cultures and only 11.8% indispersed cell cultures.It is concluded that among the modelsstudied the 3T3 feeder layer culture is the most effective andpossesses many advantages for the cultivation of human keratino-cytes;the explant culture would be a simple and easy method if wecan effectively control the contamination by fibroblasts.The growthpattern of cultured keratinocytes in each model was described.     

两种培养基对软骨细胞体外培养影响的对比研究

目的：研究不同培养基中兔关节软骨细胞生物学行为的差异，为软骨组织工程中软骨细胞的培养寻找最合适的培养基。方法：取3个月龄新西兰兔关节软骨消化获取软骨细胞，以相同密度分别用两种培养基(F-12、1640)进行培养，观察其形态、生物学行为、增生速度、特征性产物分泌量及黏附能力。分析两种培养基培养结果，对比其对体外培养关节软骨细胞的影响。结果：软骨细胞在1640培养基中贴壁、生长较快，细胞形态均一，特征性产物分泌旺盛。结论：在两种培养基中1640培养基更适合进行关节软骨细胞体外培养。     

人组织工程全层活性皮肤在深度烧伤创面的临床应用

目的 :观察人组织工程全层活性皮肤 (ActivSkin)在深度烧伤创面的临床应用效果 .方法 :采用ActivSkin修复深度创面 31例 ,观察创面愈合情况 ;观察应用ActivSkin后受体、供体的性别对创面愈合的影响 .并对病例进行随访 .结果 :治疗组深II度创面 2 5例 ,愈合时间比对照组提前 6d(P <0 .0 5 ) .III度创面 6例 ,愈合时间比对照组提前 2 0d(P <0 .0 5 ) .随访病例提示 :ActivSkin移植后组织相容性好 ,作为角质细胞和成纤维细胞三维结构支架的牛胶原膜在体内可降解 ,无免疫排异及局部炎症反应发生 .结论 :ActivSkin是一种具有生物活性、较理想的修复深度烧伤创面的新型皮肤代用品 .     

人角质形成细胞体外扩增与生物学特征变化

目的 研究人角质形成细胞体外扩增过程中生物学特征的变化,观察其角蛋白19(K19)mRNA表达及克隆形成率与扩增受限的关系。方法 取2-3岁健康儿童包皮20例,通过2.4 U/mL dispase和0.05％胰酶(tripsin)分离,获得角质形成细胞体外培养。细胞计数仪计数描绘生长曲线。光镜观察细胞体外扩增过程中形态学改变,同时计数克隆形成率。RT-PCR检测角质形成细胞K19和Involucrin的mRNA表达情况。结果 儿童包皮角质形成细胞体外平均最大扩增能力为(700±37)倍。细胞平均获得率为(1.64±0.297)×106/cm2包皮。角质形成细胞原代(P0)、第2代(P2)、第4代(P4)、第5代(P5)克隆形成率分别为:(45±4)％,(37±4)％,(28±3)％,(9±2)％,第6代(P6)克隆形成率消失。RT-PCR检测发现P0、P2、P4、P5有K19 mRNA表达,P6未见表达;Involucrin各代均可见表达。结论 人角质形成细胞体外扩增能力随传代逐渐降低,扩增受限与角质形成细胞中K19 mRNA表达及克隆形成率消失相关。     

大面积烧伤早期切痂微粒皮移植中功能部位不同方式复合皮移植的应用

目的总结大面积深度烧伤早期切痂微粒皮移植同时进行功能部位不同方式复合皮移植的经验,并探讨其治疗意义。方法 2002年4月-2011年11月收治的31例病人在大面积切痂微粒皮移植同时,功能部位54处行复合植皮术,其中脱细胞异体真皮基质(ADM)+自体超薄皮片复合移植42处,微粒皮下移植异体ADM12处。结果微粒皮+异体ADM超薄皮片复合移植成活率95%,微粒皮下异体ADM移植存活66%;术后随访复合皮移植的功能部位活动良好,瘢痕挛缩不明显,未出现明显皲裂及水疱,但遗留色素变化。局部外观及弹性以异体ADM超薄皮片复合移植效果更佳。结论烧伤早期切痂自体微粒皮移植修复创面同时对肢体功能部位联合进行复合皮移植术对于减少手术次数,促进创面尽快封闭,提供供皮区再次利用条件,保护肢体功能具有积极意义。而异体ADM超薄皮片复合移植无论存活率还是术后功能恢复均较微粒皮下ADM移植为佳。     

牙胚细胞与PLGA支架体内复合培养的实验研究

目的 摸索胎鼠牙胚细胞体外培养所需的条件及细胞-支架复合物在裸鼠体内培养的条件.方法 取17日龄的胎鼠第一磨牙牙胚组织消化成细胞悬液,然后种植于PLGA支架上,再将细胞支架复合物埋植于裸鼠皮下,术后40d后取出细胞支架复合物,观察细胞与支架的吸附及生长,繁殖情况.结果 细胞呈单层生长;细胞为多角形,紧密镶嵌成铺路石状;牙胚细胞染成蓝色,支架组织染成红色,牙胚细胞较散在分布,细胞与支架紧密贴附,适度伸展,并有基质分泌.结论 牙胚细胞支架复合物在裸鼠体内能够成活,细胞与支架紧密贴附,生长正常并有基质分泌,表明PLGA是牙组织工程良好的支架材料.     

体外长期培养人转化角朊细胞系的生物学特征

目的：研究ＳＶ４０病毒转化的人角朊细胞系在体外长期培养过程中的细胞生物学特征。方法：采用细胞培养法观察转化细胞系的克隆形成率、细胞生命曲线以及血清、Ｃａ＾＋对其生长分化的影响。结果：与正常角朊细胞相比,转化角朊细胞系于体外形成克隆所需的最低接种密度有所降低,但接触抑制特性仍未丧失。转化细胞在体外已传代培养２５代,对血清的依赖性降低,可被Ｃａ＾２＋诱导分化而形成细胞膜片结构。结论：本研究所观察的转化     

永生化表皮细胞体外快速扩增的实验研究

目的探讨获取大量皮肤组织工程种子细胞的方法和技术.方法通过真核表达载体,把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入兔表皮细胞,筛选、挑选阳性克隆在微载体-RCCS内快速扩增永生化表皮细胞.观测RCCS中微载体培养永生化表皮细胞的生长情况和检测细胞代谢率,进行抗人角细胞广谱角蛋白(AE1/AE3)免疫组化染色,并与常规培养方法进行比较.结果永生化表皮细胞在微载体-RCCS中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短(P＜0.01).在培养第10天,细胞数量可达最初接种的64倍(P＜0.01).结论联合应用微载体和RCCS培养技术,能够在体外快速、大量扩增永生化表皮细胞.     

茶多酚对原代培养的大鼠皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长的影响

目的　探讨茶多酚对原代培养的皮肤角朊细胞和成纤维细胞生长作用的影响。方法　利用原代培养的两种主要的皮肤细胞———角朊细胞和成纤维细胞,采用丙酮酸比色法、ＴＢＡ比色法和ＤＴＮＢ（双硫代对硝基苯甲酸）法测定细胞培养的上清液胞浆酶（ＬＤＨ）释放情况、脂质过氧化产物（ＭＤＡ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨＰｘ）,并测定培养细胞的生长情况,对茶多酚在皮肤中可能起到的作用进行评价。结果　在加入茶多酚后不同时间,发现茶多酚具有保护细胞膜的功能,即减少ＬＤＨ的释放、减少ＭＤＡ产生、增加ＧＳＨＰｘ含量、促进细胞生长。结论　体外实验表明茶多酚具有促进皮肤细胞生长、抗脂质过氧化的功效,其最低有效作用浓度为０．０５％～０．１％。     

Mechanical Stimulus Inhibits the Growth of a Bone Tissue Model Cultured In Vitro

Objectives To construct the cancellous bone explant model and a method of culturing these bone tissues in vitro, and to investigate the effect of mechanical load on growth of cancellous bone tissue in vtro. Methods Cancellous bone were extracted from rabbit femoral head and cut into I-ram-thick and 8-ram-diameter slices under sterile conditions. HE staining and scanning electron microscopy were employed to identify the histomorphology of the model after being cultured with a new dynamic load and circulating perfusion bioreactor system for 0, 3, 5, and 7 days, respectively. We built a three-dimensional model using microCT and analyzed the loading effects using finite element analysis. The model was subjected to mechanical load of 1000, 2000, 3000, and 4000 με respectively for 30 minutes per day. After 5 days of continuous stimuli, the activities of alkaline phosphatase （AKP） and tartrate-resistant acid phosphatase （TRAP） were detected. Apoptosis was analyzed by DNA ladder detection and caspase-3/8/9 activity detection. Results After being cultured for 3, 5, and 7 days, the bone explant model grew well. HE staining showed the apparent nucleus in cells at the each indicated time, and electron microscope revealed the living cells in the bone tissue. The activities of AKP and TRAP in the bone explant model under mechanical load of 3000 and 4000 με were significantly lower than those in the unstressed bone tissues （all P〈0.05）. DNA ladders were seen in the bone tissue under 3000 and 4000με mechanical load. Moreover, there was significant enhancement in the activities of caspase-3/8/9 in the mechanical stress group of 3000 and 4000 με （all P〈0.05）. Conclusions The cancellous bone explant model extracted from the rabbit femoral head could be alive at least for 7 days in the dynamic load and circulating perfusion bioreactor system, however, pathological mechanical load could affect the bone tissue growth by apoptosis in vitro. The differentiation of osteobiasts and osteoclasts might be inhibited after the model is stimulated by mechanical load of 3000 and 4000 με.     

早期保守去痂延期植皮修复颈部深度烧伤13例报道

目的探讨颈部深度烧伤后预防瘢痕增生挛缩畸形、避免多次整复手术的较佳治疗方法。方法颈部深度烧伤早期,采用保守削痂保留少量无生机组织。削痂后分创面给予保护,全身抗感染治疗,并予混有溶痂及促进上皮生长和局部抗炎药物的纱布覆盖创面。延期采用大张自体中厚皮片或全厚皮片修复创面,术后予热塑夹板(颈托)固定。结果本组13例患者伤后3周内创面愈合,随诊未发现明显瘢痕增生挛缩畸形,颈部活动自如,无颏、颈、胸粘连情况出现。结论本方法可促进颈部创面修复,减少瘢痕增生挛缩畸形的发生,无需整复手术纠正颈部再次瘢痕增生挛缩畸形。     

成年兔雪旺细胞体外培养增殖和纯化的实验研究

目的探讨从成年大白兔周围神经体外分离、纯化、培养的条件，观察雪旺细胞在体外存活、生长情况，目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，寻找一种较好的获取雪旺细胞的方法。方法利用成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经，剪碎至1mm的植块，经改良后反复差速贴附法进行培养，应用b-FGF刺激SC增殖；采用相差显微镜下观察雪旺细胞状态计数和S-100细胞免疫组化染色相结合鉴定；绘制生长曲线，按照细胞倍增时间公式计算其倍增时间。结果采用发生Wallerian变性后的兔双侧坐骨神经，经改良后差速贴壁培养方法能够明显抑制成纤维细胞的生长，但对雪旺细胞的生长影响较小，可获得大量高纯度的雪旺细胞，经S-100蛋白免疫组化鉴定，雪旺细胞纯度达94％以上，细胞数量达1×10^6／mL以上；绘制其生长曲线，并计算得出体外培养的第三代雪旺细胞体外倍增时间为3d；一定浓度的b-FGF和NGF可促进雪旺细胞的增殖。结论①联合采用发生Wallerian变性后的神经、改良差速贴壁培养、b-FGF和NGF促进雪旺细胞增殖是一种较经济、简便、实用的方法，可获得较高纯度的雪旺细胞。②本培养方法能够获得大量高纯度的雪旺细胞，可作为周围神经组织工程实验研究的细胞来源。     

人皮肤角质形成细胞的分离与原代无血清培养

目的 :建立一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法。方法 :采用两步消化法对皮肤进行消化 ,获取角质形成细胞进行体外无血清培养基培养 ,进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析。结果 :该方法可获取较多高纯度的角质形成细胞 ,且在体外可快速稳定增殖。结论 :两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法     

体外培养胎儿肾上腺髓质脑内移植治疗帕金森病的临床研究

采用脑立体定向技术,移植培养的人胎肾上腺髓质组织至17例重症帕金森病患者脑内尾状核头部。移植术前后进行Webster 症状评分,头颅CT 检查,腰穿脑脊液DA 测定,血免疫球的蛋白、补体和T 淋巴细胞及其亚群检查,EEG、SEP 和VEP 检查,神经心理学测验和服药方面观察,随诊3～18个月。结果提示胎儿肾上腺髓质组织在脑内存活良好,临床效果比较满意,比目前其他移植治疗方法具有临床可行性和可靠性。