版纳微型猪近交系基因组中内源性逆转录病毒序列拷贝数分析

目的:检测分析版纳微型猪近交系基因组中内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)序列的拷贝数,从而为猪源移植物的异种移植筛选理想供者.方法:用PERV的pol,env各亚型基因及envA/C重组体的特异性引物,对4个近交系亚系共50头以及5头欧洲大白猪的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的基因组DNA进行了实时定量/半定量PCR检测及普通PCR检测.结果:所有版纳猪基因组中可特异扩增出pol,envA,envB片段,其平均拷贝数分别为(24.2±9.4),(13.1±8.4)和(16.4±9.8)个,但近交系不同亚系之间各片段扩增产物量比较差异具有统计学意义(P＜0.01).所有样品中无法扩增出envC片段以及envA/C重组体.结论:版纳微型猪近交系基因组内,PERV的envA、envB和pol序列拷贝数在近交系不同亚系间比较差异有统计学意义,不存在envC和envA/C重组体序列.     

猪内源性逆转录病毒基因在版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的整合和表达研究

目的 检测猪内源性逆转录病毒（PERV）在猪细胞长期传代过程中的基因整合和表达。方法 通过提取已建立的版纳微型猪近交系（BMI）骨髓问充质干细胞（MSCs）永生细胞系的DNA及细胞总RNA,用PCR、RT—PCR方法检测PERV前病毒gag、pol和env基因的整合和表达,并对PERV的亚型进行鉴定。结果 从原代BMI—MSCs至连续传代到150、180代的BMI—MSCs细胞基因组中都检测到了PERV前病毒DNA的整合及其mRNA的表达．PERV亚型为PERV—A、B型。结论 PERV在BMI近交过程中及猪细胞体外长期传代过程中均未消扔,PFRV基因已经整合入其天然宿主的基因组内并能稳定表达。     

中国两头乌猪品种内源性逆转录病毒基因研究

目的 对5个中国两头乌猪品种（通城猪、东山猪、沙子岭猪、赣西两头乌猪和金华猪）及3个国外品种（大白猪、长白猪和杜洛克猪）猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag) 基因、多聚酶(pol) 基因、囊膜(env) 基因的三个亚型A、B、C，分别从DNA和RNA水平上进行研究，以发现中国两头乌猪品种在异种器官移植中的资源优势。方法 利用PCR方法在DNA水平上对PERV基因的3个亚型进行鉴定，并通过半定量PCR方法在RNA水平上检测通城猪和大白猪PERV各亚型在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、淋巴和脑组织中的表达谱。结果 4个华中两头乌猪种中env-AB型为主要PERV亚型，分别占被测总数的92%～100%。在这4个品种中均没有检测到C亚型，金华猪以及3个国外猪种中均检测到了C亚型，病毒亚型种类也更丰富。半定量PCR实验结果显示gag、pol基因在两个品种9个组织中广泛表达，env-A在通城猪的心、肝、肺、脂肪和淋巴组织中表达量较低，env-B在通城猪的心脏和淋巴组织中表达量较低，而env-B在大白猪的肾脏中表达很低，其他所测8个组织中表达量都较高。结论 通城猪、东山猪、赣西两头乌猪和沙子岭猪可以做为较佳的异种移植候选供体，具有良好的应用前景。     

湖南大围子猪内源性逆转录病毒的研究

目的：研究湖南大围子猪携带的内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV），为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法：从湖南大围子猪的保种群内随机采集42头个体的耳样组织，应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中PERV前病毒DNA和mRNA，并对PCR扩增的灵敏性进行评估。扩增、测序大围子猪的PERV env基因，结果用美国生物信息中心（National Center for Biotechnology Information）的BLAST软件进行分析。结果：所检测的42头大围子猪均带有PERV前病毒DNA，耳样组织中均有PERV mRNA表达，所有个体携带env-A，env-B和env-C3种囊膜蛋白基因。测序结果表明，大围子猪env-A和env-C与GenBank登录其他猪种序列（AY288779，AY534304）相比分别存在1和8个碱基的差异，而env-B基因没有碱基差异。结论：大围子猪种群携带PERV，而且均具有转录活性，亚型主要为PERV-ABC；大围子猪的PERVenv-A，env-C存在基因多态性，从生物安全性方面考虑，该猪种不宜作为异种移植供体。     

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的 克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况.方法 从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序.并采用半定量RT-PCR方法分析版纳微型猪近交系不同组织中AQP3基因的表达情况.结果 成功克隆出AQP3基因编码区全长873 bp的序列,GenBank登录号为HQ888860,其编码290个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,与牛的AQP3基因同源性最大,达99％.多组织半定量RT-PCR研究表明AQP3 mRNA在BMI猪的脾脏、肾脏、肺、小肠中均有表达,其中脾脏中表达最高.结论 成功克隆出了版纳微型猪近交系AQP3基因全长编码区,并对其编码的蛋白质功能进行了预测,为进一步的功能研究奠定了基础.     

猪内源性反转录病毒在中国实验小型猪中的存在与表达

目的对中国实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与mRNA的表达进行检测,摸清中国实验小型猪中内源性反转录病毒的携带情况.方法根据已发表的PERV的序列设计并合成了三对引物,分别用于检测PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在与表达;同时,根据目前通用的env基因分型方法合成了三对用于分型检测的引物env-A、env-B、env-C.应用PCR、RT-PCR扩增的方法,对来自于中国实验小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行了检测.结果在6个被检DNA样品中均检出了PERV特异性DNA的存在;同样,在被检RNA样品中均有PERV特异性RNA的表达,且所表达的PERV均为A型和B型,在所有样品中均未检出C型PERV的表达.结论初步表明中国实验小型猪中存在内源性反转录病毒序列,且能以mRNA的形式表达,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础.     

基于微滴式数字PCR技术对猪内源逆转录病毒拷贝数的检测方法的建立及应用

目的利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)技术,对猪基因组中猪内源逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)拷贝数测定方法进行优化,建立PERV拷贝数的检测方法。方法采用Taq Man探针双重dd PCR方法,分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFRC)为内参基因,确定对PERV拷贝数检测反应最适合退火温度和反应循环数。另外,通过对浓度梯度稀释的标准品质粒和猪细胞基因组进行检测,以确定最适模板浓度。采用dd PCR和q PCR两种方法测定来自猪源细胞系和巴马小型猪组织中PERV的拷贝数,比较两种检测方法的稳定性。结果基于dd PCR技术检测PERV拷贝数的最适退火温度为59.9℃,最佳反应循环数为50;模板基因组的最适浓度在1.25～7.5 ng;检测同一样品来源基因组中PERV的拷贝数的变异系数在0.44%～8.29%。结论本研究建立了基于dd PCR技术的PERV拷贝数的检测方法并系统的探索了最佳实验条件,与传统的q PCR相比,该方法具有更高的准确性和可重复性,为异种移植研究中供体动物基因组PERV拷贝数的测定提供了灵敏的方法和可靠依据。     

用12对微卫星引物对版纳小耳猪近交系的遗传学分析

目的　分析版纳小耳猪近交系种群的遗传变异及近交程度。方法　利用 12个微卫星基因座对版纳小耳猪近交系进行了遗传检测。结果　两个亚系以及各家系的聚类情况与小型猪系谱分布一致。且各家系基因纯合率均较高。结论　版纳小耳猪近交系不仅分化为若干个含有不同性状的家系 ,而且也达到了一个很高的近交程度。     

版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的 获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法 以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果 克隆出了BMI GHR 编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p. E381D、p. A409S、p. L556V和p. A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示：GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论 成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

猪到人异种移植匹配性研究

器官移植是治疗人类脏器终末期功能衰竭疾病的唯一有效手段。供器官严重短缺是限制临床移植发展的瓶颈之一。全球认为猪是最具潜力的异种供器官源。但其能否应用于临床的最重要指标是猪-人器官功能是否匹配,是否长期安全和免疫差异能否克服。本研究旨在选择我国自主知识产权的版纳微型猪近交系(Banna minipig inbred line,BMI)和五指山猪近交封闭群(Wuzhisan pig,WZSP),研究其脏器结构、功能与人相应器官的移植匹配性、猪→人异种移植的免疫障碍、评价猪→人异种移植的可行性和安全性。1.近交系或封闭群猪遗传背景调查——DNA指纹图与…     

Expressed sequence tags analysis of a liver tissue cDNA library from a highly inbred minipig line

Background Porcine liver performing efficient physiological functions in the human body is prerequisite for successful liver xenotransplantation. However, the protein differences between pig and human remain largely unexplored. Therefore we investigated the liver expression profile of a highly inbred minipig line. Methods A cDNA library was constructed from liver tissue of an inbred Banna minipig. Two hundred randomly selected clones were sequenced then analysed by BLAST programme. Results Alignments of the sequences showed 44% encoded previously known porcine genes. Among the 56% unknown genes, sequences of 72 clones had high similarities with known genes of other species and the similarities to human were mostly above 0.80. The other 40 clones showing no similarity to genes in National Centre for Biotechnology Information are newly discovered, expressed sequence tags specific to liver of inbred Banna minipig. Twenty-two of the 200 clones had full length encoding regions, 38 complete 5＇ terminal sequences and 140 complete 3＇ terminal sequences. Conclusion These newly discovered expression sequences may be an important resource for research involving physiological characteristics and medical usage of inbred pigs and contribute to matching studies in xenotransplantation.     

中国版纳小型猪近交系肝脏的应用解剖

目的　解剖观察中国版纳小型猪近交系肝脏 ,为肝脏异种移植提供形态学依据。方法　 10头版纳小型猪近交系 ,10 %甲醛常规灌流固定 ,观测肝脏的外形、韧带及出入肝脏的管道系统。结果　版纳小型猪近交系肝脏外形、韧带、门静脉与肝固有动脉管径与人类似 ,分为 4叶 ,大小、质量、胆总管及后腔静脉管径相对较小。结论　版纳小型猪近交系肝脏在形态上具备异种移植供体的条件     

广西巴马小型猪PERV-env基因克隆及其组织表达谱分析

目的克隆广西巴马小型猪PERV-env部分基因,并研究其在不同组织中的表达差异。方法利用RT-PCR方法从巴马小型猪外周血白细胞中扩增PERV-env基因,并与部分国内外已发表的PERV-env基因序列进行同源性及遗传进化分析。以扩增获得的广西巴马小型猪PERV-env基因为模板设计引物,利用半定量RT-PCR的方法对广西巴马小型猪不同组织中PERV mRNA表达情况进行分析。结果在所检测的9个组织样品中PERV mRNA相对表达水平存在差异,肾及外周血淋巴细胞中PERV mRNA丰度最高,肺、心、肝、脾、胸腺、卵巢次之,且表达丰度差异不显著(P0.05),胰腺PERV mRNA表达丰度最低。结论以巴马小型猪胰岛细胞进行异种移植发生PERV感染的潜在危险性可能要低于其它器官,但仍需进一步研究证实。     

1997～2002年山东省HIV-1流行株env基因序列测定和亚型分析

①目的对1997～2002年间山东地区HIV-1各亚型分离株进行基因分型，了解各亚型的分布及其与传播途径的相互关系。②方法采集1997～2002年间山东省38例HIV-1感染者的抗凝全血标本，用巢式PCR技术扩增外周血单个核细胞中HIV-1前病毒env基因C2～V3区，并对C2～V3区的核苷酸序列进行测定和分析。⑧结果山东省38例HIV-1分离株中存在亚型和重组毒株4种（A、B、C、A／E）。其中A亚型5株，B亚型22株（其中包括泰国B亚型11株），C亚型10株，A／E重组毒株1株。各亚型内的离散率有差异，A、B、c亚型内基因离散率分别为1．5％、8．6％和1．9％。在性乱人群和静脉吸毒人群中以A亚型和C亚型为主；在职业献血和不安全血制品使用者中以B亚型为主。④结论1997～2002年间山东省HIV-1流行特点为A、B、c亚型共存，伴有重组毒株；传播途径复杂，基因变异较大，B亚型仍然为主要流行株。     

化学发光加强法核酸标记检测系统用于猪DNA指纹分析的研究

目的　探讨化学发光加强法(ECL)核酸直接标记和检测系统应用于猪的DNA指纹分析的可行性。方法　采用人源α-珠蛋白3'HVR探针,应用ECL核酸直接标记和检测系统,对西双版纳小耳猪进行了Southern杂交DNA指纹分析,获得了最适实验条件。结果　取10μg基因组DNA于30μl反应体系中,加入HinfⅠ或HaeⅢ内切酶3～5U/μgDNA,酶切消化4h,消化液在50V电压条件下4℃电泳20h,采用真空转移法进行脱嘌呤、碱变性、中和及转膜,时间分别为15min、15min及20min,转膜采用20×SSC真空转移1h至hybondN+尼龙膜上,大大提高了转膜效率。以HRP标记探针进行管中杂交,以化学发光法进行检测,室温放射自显影30min,获得了清晰可辨的DNA指纹图。结论　该方法可用于猪的DNA指纹分析,其效果与同位素标记探针的效果基本一致。     

版纳微型猪染色体显带研究

采用外周血淋巴细胞及肺成纤维细胞培养方法，以及Ｃ带、Ｇ带显带和银染技术，对云南版纳微型猪进行了染色体显带研究。测量了染色体的相对长度，着丝点指数及臂比。结果表明，Ａｇ－ＮＯＲｓ定位于７号和１０号染色体，版纳微型猪的Ｇ带带型与其它家猪相似，Ｃ带和Ａｇ－ＮＯＲｓ具有多态性。