Ⅰ型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究

目的 观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体.方法 将人脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率.结果 脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖.结论 Ⅰ型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体.     

人脂肪干细胞与不同浓度纤维蛋白胶的相容性研究

目的 研究人脂肪干细胞(ASCs)与不同浓度纤维蛋白胶支架的体外生物相容性.方法 获取人原代ASCs,鉴定后通过CCK-8试验检测纤维蛋白胶对ASCs的毒性.通过光镜直接观察和活细胞/死细胞(DEAD/LIVE)双标染色荧光观察ASCs分别与100.0、50.0、25.0、12.5 mg/mL 4组不同浓度纤维蛋白胶支架三维培养后ASCs的生长状况.结果 CCK-8试验显示纤维蛋白胶对ASCs无明显毒性.通过光镜直接观察及DEAD/LIVE双荧光染色后观察显示ASCs与不同浓度纤维蛋白胶复合后细胞呈立体三维生长,ASCs增殖速率和健康程度(DEAD/LIVE值)随纤维蛋白浓度降低而提高,低于25.0 mg/mL时细胞增殖速率和健康程度趋于良好.结论 ASCs与纤维蛋白胶支架具有良好的体外生物相容性,纤维蛋白浓度低于25.0 mg/mL为与ASCs三维培养的适宜浓度.     

多肽二维凝胶支架材料与鼠神经干细胞的细胞相容性

目的研究鼠神经干细胞在二维自组装多肽凝胶支架材料表面生长及分化情况，证明多肽凝胶可作为神经组织工程支架材料。方法取新生1周内乳鼠的大脑皮质，机械分离出神经干细胞，无血清培养液（DMEM／F12＋bFGF＋EGF＋B27）培养，免疫组化SABC法对神经干细胞进行鉴定；然后，将其接种到凝胶支架材料表面（实验组）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面（对照组），倒置相差显微镜观察干细胞的生长及分化情况。结果免疫组化法鉴定：培养的细胞为神经干细胞，Nestin（＋）。神经干细胞可分化为神经元及星形胶质细胞，NSE（＋），GFAP（＋）。倒置相差显微镜观察：实验组中。接种的神经干细胞生长良好，7d后可分化为有突起神经细胞；对照组中，7d后未发现长出突起神经细胞。结论二维自组装多肽凝胶对神经干细胞有良好细胞相容性，可作为神经组织工程支架材料。     

脂肪源间充质干细胞与异种骨支架材料生物相容性研究

目的 制备并检测异种骨支架材料和种子细胞的生物相容性、验证脂肪源间充质干细胞作为种子细胞及异种骨作为支架材料的可行性.方法 制备异种骨支架材料,并与脂肪源间充质干细胞复合培养,分别做扫描电镜观察、细胞活性检测和碱性磷酸酶的测定,各组均以人同种异体骨支架材料作对照.结果 复合培养4和10 d后电镜下两种材料均见到脂肪源性间充质十细胞的存活并伸出伪足黏附在材料上:MTT法显示两组材料上的细胞增殖数均随时间的延长而呈增长趋势;与同种异体骨支架材料相比,异种支架材料内细胞碱性磷酸酶的变化趋势与其基本一致,均随时间的延长而增高.结论 脂肪源间充质干细胞与异种骨支架材料有较好的生物相容性,两者复合构建组织化工程骨的前景值得进一步研究.     

大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架相容性研究

目的观察大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架体外相容性,为周围神经组织工程寻求合适的种子细胞载体。方法将大鼠脂肪干细胞与去细胞神经支架体外体外复合培养,采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上的生长、黏附情况,MTT法测定细胞活性并与空白对照组比较。结果脂肪干细胞在去细胞神经支架上生长、黏附情况良好。结论两者具有很好的体外组织相容性,去细胞的神经支架可以作为有效的周围神经组织工程的细胞载体。     

人脂肪干细胞与聚L-谷氨酸/海藻酸钠可注射水凝胶的生物相容性研究

天然高分子聚合物聚L-谷氨酸(PLGA)与氧化海藻酸钠(OAg)共价交联合成PLGA/OAg水凝胶,将人脂肪来源干细胞(hADSCs)接种于水凝胶内,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞在支架中的存活、增殖、黏附情况,DNA定量法检测细胞的增殖。体外证实该水凝胶材料生物相容性良好,具有性能可控性和微创性等优势,对于进一步开发脂肪组织工程材料具有指导性意义。     

胶原凝胶复合CPPf/PLLA支架与软骨细胞的相容性研究

目的研究软骨细胞与胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架的细胞相容性,为软骨组织工程提供适宜的种子细胞载体。方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞整合入CPPf／PLLA三维支架并进行体外培养,采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上粘附、生长和增殖等情况,从组织学和Ⅱ型胶原免疫组化对复合组织进行评价。结果软骨细胞能良好地在支架上粘附、生长和增殖,新形成的组织为透明软骨样组织、细胞外基质有Ⅱ型胶原分布。结论胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架具有良好的细胞相容性,可作为软骨细胞栽体。     

静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纤维支架与兔脂肪源干细胞的体外生物相容性研究

目的利用兔脂肪源干细胞评价静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纤维支架的生物相容性。方法脂肪源干细胞取自新西兰白兔皮下脂肪组织,经分离、培养后接种到待检支架上,使用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上的生长形态;MTT法比较支架上培养和常规培养条件下的脂肪源干细胞生长曲线与倍增时间。结果脂肪源干细胞在纤维支架上生长良好,生长曲线与常规培养时基本一致,两组间细胞倍增时间差异无统计学意义(P>0.05)。结论脂肪源干细胞能够在静电纺丝聚乳酸/聚己内酯共混纤维支架材料上正常生长增殖,该支架材料生物相容性好。     

转染Ad-hBMP2的脂肪干细胞与壳聚糖/磷酸三钙复合物支架的相容性

目的探讨转染腺病毒骨形态发生蛋白(Ad-hBMP2)基因的脂肪干细胞(ADSCs)与壳聚糖/磷酸三钙(CTCP)复合物支架的相容性,以期为ADSCs修复骨缺损寻找理想的组织工程骨支架材料。方法将壳聚糖与磷酸三钙进行复合制成CTCP复合物材料,再将其与转染Ad-hBMP2的ADSCs(密度1×106/mL)复合培养,进行细胞复合物支架的一般与超微形态学观察,观察细胞粘附能力、增殖活力,RT-PCR及Western blot测定成骨细胞骨钙素和Ⅰ型胶原水平。结果 CTCP支架孔径200～350μm,孔隙率83%;电镜显示转染Ad-hBMP2的ADSCs与CTCP复合物在体外培养期间支架无塌陷及形变,且其在支架上粘附、增殖良好,并能分泌细胞外基质如骨钙素和Ⅰ型胶原等;随着培养时间延长,骨的组织学特征日益明显。结论 CTCP支架具有适宜的孔结构和良好的生物相容性及骨诱导作用,可以作为骨组织工程较理想的支架材料,且与转染Ad-hBMP2的ADSCs相结合更易形成组织工程骨。     

诱导向尿路上皮分化的脂肪干细胞与膀胱脱细胞基质支架的生物相容性研究

目的 探讨脂肪干细胞向尿路上皮细胞分化的可行性,并将诱导后细胞与膀胱脱细胞基质复合培养,评价细胞与支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化组织提供实验基础。 方法 取6只8周龄雄性新西兰大白兔的腹股沟脂肪组织和膀胱组织,通过胶原酶消化法分离脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),同时通过胰蛋白酶消化的方法获取尿路上皮细胞,流式细胞鉴定后将第3代脂肪干细胞与尿路上皮细胞间接共培养2周,并对分化后细胞进行表型鉴定。随后将分化后细胞种植在膀胱脱细胞基质上,通过扫描电镜、组织学切片观察诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上的生长情况。 结果 脂肪干细胞培养成功并在体外扩增,流式术检测表面抗原CD分子,细胞高表达CD29(99.6%)、CD44(98.2%);低表达CD31(1.9%)及CD45(1.6%)。通过间接共培养诱导分化后,细胞免疫荧光、Western blotting检测到尿路上皮标志物UPIa的表达,而未诱导的脂肪干细胞无表达。扫描电镜提示诱导后细胞在膀胱脱细胞基质上生长,黏附较好。组织学检查可见膀胱脱细胞基质表面细胞平铺生长。 结论 脂肪干细胞向尿路上皮诱导分化后可作为泌尿系组织工程的种子细胞,可能是尿路上皮细胞之外的又一新选择。膀胱脱细胞基质能支持诱导后的脂肪干细胞良好的生长,该支架可作为载体材料用于泌尿系组织工程的修复与重建。      

人脂肪源性干细胞成骨诱导过程中I型胶原的表达

目的：研究人脂肪源性干细胞（hADSCs）成骨诱导后其合成和分泌Ⅰ型胶原能力的变化,探讨hADSCs作为组织工程骨的种子细胞的效能。方法：从人脂肪抽吸物中分离基质细胞,体外培养、扩增及鉴定。采用成脂诱导剂诱导hADSCs向脂肪细胞分化,采用油红O染色鉴定。采用成骨诱导剂诱导hADSCs向成骨细胞分化,将成骨诱导组分为0、7、14、21和28 d组,分别于0、7、14、21及28 d行茜素红染色检测矿化结节、Van Gieson胶原纤维特殊染色染胶原纤维、Ⅰ型胶原细胞免疫荧光染色检测细胞Ⅰ型胶原的表达。用FV Viewer 1.7软件对Ⅰ型胶原表达的强度进行定量检测。结果：hADSCs成脂诱导14 d后油红O染色阳性;hADSCs成骨诱导21 d茜素红染色阳性;成骨诱导21 d Van Gieson胶原纤维特殊染色阳性;hADSCs成骨诱导后Ⅰ型胶原染色21 d所有的细胞均阳性表达,28 d呈强阳性表达。统计结果显示：Ⅰ型胶原的表达从7 d开始,到28 d逐渐升高,7、14、21和28 d组与0 d组比较差异均有显著性（P<0.05）。结论：hADSCs成骨诱导后全部细胞呈现成骨表型,成骨能力强,可以作为骨种子细胞应用于临床骨再生治疗。     

Differentiation of adipose-derived stem cells towards nucleus pulposus-like cells induced by hypoxia and three-dimensional chitosan-alginate gel scaffold in vitro

Background Injectable three-dimensional (3D) scaffolds have the advantages of fluidity and moldability to fill irregular-shaped defects, simple incorporation of bioactive factors, and limited surgical invasiveness. Adipose-derived stem cells (ADSCs) are multipotent and can be differentiated towards nucleus pulposus (NP)-like cells. A hypoxic environment may be important for differentiation to NP-like cells because the intervertebral disc is an avascular tissue. Hence, we investigated the induction effects of hypoxia and an injectable 3D chitosan-alginate (C/A) gel scaffold on ADSCs. Methods The C/A gel scaffold consisted of medical-grade chitosan and alginate. Gel porosity was calculated by the liquid displacement method. The pore microstructure was analyzed by light and scanning electron microscopy. ADSCs were isolated and cultured by conventional methods. Passage 2 BrdU-labeled ADSCs were co-cultured with the C/A gel. ADSCs were divided into three groups (control, normoxia-induced, and hypoxia-induced groups). In the control group, cells were cultured in 10% FBS/DMEM. Hypoxia-induced and normoxia-induced groups were induced by adding TGF-β1, dexamethasone, vitamin C, sodium pyruvate, proline, bone morphogenetic protein-7, and 1% ITS-plus to the culture medium and maintained in 2% or 20% O2, respectively. Histological and morphological changes were observed by light and electron microscopy. ADSCs were characterized by flow cytometry. Cell viability was investigated by BrdU incorporation. Proteoglycan and type II collagen were measured by safranin O staining and the Sircol method, respectively. mRNA expression of hypoxia inducing factor-1α (HIF-1α), aggrecan, and type II collagen was determined by RT-PCR. Results C/A gels had porous exterior surfaces with 80.57% porosity and 50–200 μm pore sizes. Flow cytometric analysis of passage 2 rabbit ADSCs showed high CD90 expression, while CD45 expression was very low. The morphology of induced ADSCs resembled that of NP cells. BrdU immunofluorescence showed that most ADSCs survived and proliferated in the C/A gel scaffold. Scanning electron microscopy showed that ADSCs grew well in the C/A gel scaffold. ADSCs in the C/A gel scaffold were positive for safranin O staining. Hypoxia-induced and normoxia-induced groups produced more proteoglycan and type II collagen than that in the control group (P <0.05). Proteoglycan and type II collagen levels in the hypoxia-induced group were higher than those in the normoxia-induced group (P <0.05). Compared with the control group, higher mRNA expression of HIF-1α, aggrecan, and type II collagen was detected in hypoxia-induced and normoxia-induced groups (P <0.05). Expression of these genes in the hypoxia-induced group was significantly higher than that in the normoxia-induced group (P <0.05). Conclusions ADSCs grow well in C/A gel scaffolds and differentiate towards NP-like cells that produce the same extracellular matrix as that of NP cells under certain induction conditions, which is promoted in a hypoxic state.     

Neurogenesis of adipose-derived stem cells in hydrogel

Adipose tissue is a readily available source of adult stem cells with multipotent properties suitable for tissue engineering and regenerative medical applications. Peptide hydrogel is a novel biomaterial which provides three-dimensional microenvironments for a variety of cells for tissue grafting. In this study, adipose-derived stem cells (ADSCs) were isolated from rats, seeded into the peptide hydrogel polymer scaffolds and cultured in Neurobasal (NB) media supplemented with B27, basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF). Ten days after the culture, some cells were expanded into clonal populations in which the expression of both Nestin and Brdu was detected but only Brdu expression was detected in the cells that were not expanded into clonal populations. Our results suggested that ADSCs in peptide hydrogel polymer scaffolds can be induced to differentiate into cells capable of expressing the neuron-associated markers, self-renewal and self-propagation.     

人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的:观察人脂肪基质干细胞(ADSCs)体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法:(1)人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术,酶消化法分离出ADSCs,体外培养扩增.(2)取第3代ADSCs,测细胞生长曲线,流式细胞仪测原代细胞表面标记;成脂和成软骨诱导分化.(3)倒置显微镜观察油红O、阿尔辛蓝(AB-PSA)染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测分化情况;RT-PCR检测相关标志基因表达.结果:(1)体外培养的ADSCs细胞形态均一,传代稳定.(2)经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红O染色呈红色,RT-PCR检测到有Leptin、PPAR-γ表达;经成软骨诱导,AB-PSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色,RT-PCR检测COLLⅡ、SOX9和aggrecan表达.结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞.     

脂肪基质干细胞跨胚层分化为神经干细胞的实验研究

目的：探讨脂肪基质干细胞向神经干细胞跨胚层分化的可行性,进而为神经系统损伤修复寻找理想的种子细胞．方法：无菌条件下取大鼠腹股沟脂肪组织,消化离心后低糖含血清培养基培养,待细胞生长至亚融合状态改用神经干细胞培养基诱导,用免疫荧光对诱导的细胞进行鉴定．结果：大鼠脂肪基质干细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的细胞,后者形成细胞球（或称“神经球”）,该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快形成新的神经球．神经干细胞球进一步分化,可见到有的细胞胞体增大并出芽,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系,表达Nse或Gfap抗原．结论：大鼠脂肪基质干细胞在一定条件下可以向神经干细胞跨胚层分化．该种来源的神经干细胞可能成为中枢神经系统损伤修复的理想种子细胞．     

多肽水凝胶复合支架对大鼠脂肪干细胞体外增殖和分化的影响

目的:研究多肽水凝胶复合骼金(nano-hydroxyapatite/collagen, nHAC)对大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖和早期骨向分化的作用?方法:用1%的多肽水凝胶与nHAC制备复合支架,未复合水凝胶的nHAC为对照组,使用扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)和共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)进行表征,将ADSCs接种到两种支架材料上,以CCK-8检测1?3?5?7 d的增殖情况,以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其3?5?7 d 的活性?结果:多肽水凝胶在nHAC表面形成涂层,ADSCs在有涂层的nHAC上黏附?铺展得更好,两种支架上的ADSCs在1?3?5?7 d都持续增殖,其中两组间在1?3 d无差异,5?7 d有差异,实验组增殖更快(P < 0.05);ALP值在3?5?7 d都持续增高,实验组更高,两组间有差异(P < 0.05),但在3?5?7 d时两两比较差异不显著(P > 0.05)?结论:多肽水凝胶复合支架材料能显著促进ADSCs的黏附增殖,对细胞早期骨向分化有一定的促进作用,但不如对细胞增殖的促进作用显著?     

hASCs的单克隆培养及干细胞相关标志物表达的实验研究

目的 通过对人体脂肪组织来源干细胞(hASCs)进行单克隆培养,以获得单克隆hASCs.并比较不同克隆干细胞相关标志物的表达.方法 ①临床手术切取脂肪组织,经胶原酶消化法原代培养,细胞培养并传至第2代后,有限稀释法进行克隆形成实验.②针对获得的单克隆hASCs,用流式细胞仪检测小同克隆CD29、CD34、CD44、CD54、CD106、ABCG2的表达.结果 ①通过克隆形成实验共获得10个单克隆细胞群,并成功扩增到第9代后冻存.②不同克降细胞群体具有相似的成纤维细胞样形态,但增殖活力各异.③干细胞相关标志检测显示:各个群体均高表达CD29(92.9±7.4%)、CD44(94.6±6.8%),低表达ABCG2(2.5±1.4%),但CD34、CD54和CD106的表达在不同群体问有明显差异.结论 酶消化法获得hASCs是含有不同分化潜能干细胞以及其他多种细胞的混合群体.用单克隆培养的方法可能获得纯化的单一细胞群,不同的克隆之间的表面抗原表达既有共性和义有差异,这种差异可能与不同克隆间分化潜能的不同相关.     

脂肪干细胞在肌腱组织工程中的研究进展

严重的肌腱缺损带来严重的社会及经济负担，传统治疗方法效果欠佳。肌腱组织工程为治疗严重的肌腱
缺损提供了新的方向。脂肪干细胞较骨髓干细胞有来源广泛，分离过程简单、安全等优点，具有向多种细胞分化的
潜能及强大的自我增殖能力。脂肪干细胞在生长因子、周期性张力及氧分压等适宜刺激下可分化为肌腱细胞，分泌
肌腱细胞外基质，形成组织化工程肌腱以修复严重缺损的肌腱，改善因肌腱缺损导致的功能障碍。