精子蛋白17在卵巢癌中的表达及其意义

目的:探讨精子蛋白17在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌组织学分型,肿瘤分化程度及临床分期预后的关系.方法:对48例上皮性卵巢癌手术切除的石蜡包埋组织标本用自制的Sp17单克隆抗体进行免疫组化染色,研究Sp17在卵巢癌组织中的表达,并结合临床资料,探讨Sp17的表达与卵巢癌组织学分型、肿瘤分化程度(分级)及临床分期、预后的关系.结果:Sp17在上皮性卵巢癌的阳性表达率达43.8%(21/48),Sp17的表达与上皮性卵巢癌的组织学类型、肿瘤分化程度及临床分期无相关性,Sp17阳性患者生存时间似较阴性者为长,但无统计学意义.结论:Sp17在上皮性卵巢癌中有较高的表达率,值得进一步研究.     

精子蛋白17 mRNA在卵巢癌中的表达及临床意义

目的：测定精子蛋白(Sp)17mRNA在肿瘤组织中表达情况。方法：设计合成特异性引物，建立测定人Sp17mRNA的RT-PCR的方法，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内标。检测13份原发卵巢癌组织标本、3份卵巢癌腹水标本和13份其他肿瘤组织标本。用正常睾丸组织RNA作模板进行RT-PCR作为阳性对照，正常卵巢组织为阴性对照。阳性对照可出现2个条带，其中Sp17扩增产物近500bp，β-actin产物234bp。阴性对照仅出现β-actin条带。结果：13份原发卵巢癌组织标本中，11例表达Sp17mRNA，阳性率为84．6％。3份卵巢癌腹水标本中，1份检出Sp17mRNA。其他肿瘤组织标本全部阴性。结论：Sp17mRNA在原发卵巢恶性肿瘤中高水平表达，可以作为临床诊断的辅助指标。     

血清精子蛋白17检测的双抗夹心ELISA法及在卵巢癌诊断中的应用

目的:建立双抗夹心ELISA法检测血清中精子蛋白17(sperm protein 17, Sp17)水平.方法:以重组Sp17蛋白为免疫原制备兔抗Sp17抗体,建立Sp17双抗夹心ELISA检测方法,鉴定其最小检出限、精确度、回收率,并检测42例正常人及28例卵巢癌患者血清Sp17水平.结果:该双抗夹心ELISA法敏感度高、特异性强、重复性好.卵巢癌患者与正常人血清Sp17含量有显著差别(P＜0.01),正常人血清中存在少量Sp17蛋白,而卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高者占39.3%.结论:卵巢癌患者血清中Sp17含量明显升高.测定血清Sp17水平的ELISA方法学确立为阐明Sp17在卵巢癌患者中的免疫生物学意义提供了实验手段.     

绿色荧光蛋白标记的人卵巢癌裸鼠原位移植模型的建立

目的 应用绿色荧光蛋(GFP)基因标记人卵巢癌细胞株H08910,建立新型裸鼠原位移植瘤模型.方法 将处于对数生长期的人卵巢癌细胞株H08910/GFP 2×106个细胞注射于裸鼠腋下,收集瘤块后接种于左侧卵巢包膜下,共6只.术后利用荧光体视显微镜连续观察肿瘤生长情况,4周后处死荷瘤鼠,观察肿瘤生长及转移情况.结果 种植的原位移植瘤成瘤率100%,移植后2周可观察到左侧肋脊角处绿色荧光团,并逐渐增大,4周后,可见肿瘤侵及腹膜、网膜、肠管、脾脏、肝脏、子宫、盆腔淋巴结,转移率达66.7%.结论 成功建立新型裸鼠原位人卵巢癌的动物模型.     

人结肠腺癌细胞HCT－8绿色荧光标记肿瘤模型的建立

目的 筛选表达绿色荧光蛋白基因的人的单克隆结肠腺癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长建立一种新的肿瘤动物模型.方法 以脂质体2000介导chicken β-actin-GF-P-NEO转染人结肠腺癌细胞HCT-8,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养.BALB/CA-nu裸鼠皮下接种1×106个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况.结果获得了稳定表达GFP的人结肠腺癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程.肿瘤的发光随着观察时间的延长而增加.结论 绿色荧光蛋白能够在人结肠腺癌细胞HCT-8中长期稳定表达,用绿色荧光蛋白标记的人结肠腺癌细胞HCT-8建立的裸鼠肿瘤模型为进一步研究结肠肿瘤和相应的药物筛选提供了一种简便、可行的新方法 .     

人结直肠癌细胞HCT116红色和绿色荧光标记肿瘤模型的建立

目的筛选表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因的人的单克隆结直肠癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长建立一种新的肿瘤动物模型。方法以脂质体2000介导chickenβ-actin-GFP-neo和chickenβ-actin-DsRed-neo转染人结直肠癌细胞HCT-116,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达红色和绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养。BALB/CA-nu裸鼠皮下接种1×10^6个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况。结果获得了稳定表达GFP、DsRed的人结肠癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程,肿瘤的发光随着观察时间的延长而增加。结论红色和绿色荧光蛋白能够在人结直肠癌细胞HCT-116中长期稳定表达,用红色和绿色荧光蛋白标记的人结直肠癌细胞HCT-116建立的裸鼠肿瘤模型为进一步研究结肠肿瘤和相应的药物筛选提供了一种简便、可行的新方法。     

人精子蛋白17基因在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆人精子蛋白17(hSp17)基因,构建重组表达载体并表达重组蛋白. 方法: 用RT-PCR法从人睾丸中克隆hSp17基因,构建重组表达质粒pET-28a( )/hSp17,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,用特异性hSp17的mAb进行Western blot鉴定,Ni-NTA His-Bind树脂纯化重组蛋白. 结果: 克隆到hSp17 cDNA(456 bp)并经过DNA测序证实,表达和纯化得到重组蛋白hSp17(表观Mr为27 500),并经过Western blot鉴定. 结论: 成功克隆和表达hSp17 基因.     

PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入人主动脉平滑肌细胞

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人平滑肌细胞的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和培养的人平滑肌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入人平滑肌细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和人平滑肌细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人平滑肌细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的大分子抗平滑肌细胞增殖进行血管成形术后再狭窄的蛋白治疗奠定了基础。     

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞

目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200μmol/L时对细胞仍无毒性。结论PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。     

PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白基因的表达

目的：研究PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达。方法：用脂质体转染法将增强型GFP基因转入PC12细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞GFP表达及荧光强度。用碘化丙啶(PI)标记缺氧血清剥夺再灌流后的PC12／GFP细胞,在流式细胞仪上分选GFP阳性(活)细胞并测定其比例。结果：克隆转移后几乎所有细胞表达GFP,可连续稳定传40代以上。流式细胞仪可精确分选出GFP( )／PI(-)、GFP( )／PI( )、GFP(-)／PI(-)、GFP(-)／PI( )4组细胞。结论：增强型GFP基因可在PC12细胞中稳定高表达。PC12／GFP细胞株的建立为短暂脑缺血再灌流后干预治疗的研究提供了理想的对照实验细胞模型。     

绿色荧光蛋白基因标记的肺癌细胞株的建立

目的 建立能稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的肺癌细胞株,为研究肺癌的浸润与转移机制打下基础.方法 利用逆转录病毒将EGFP导入人高转移肺癌细胞株95D,经过G418筛选和克隆化培养,用荧光显微镜及流式细胞仪检测EGFP基因在癌细胞体外的表达,绘制细胞生长曲线,检测细胞贴壁率等,观察稳定表达EGFP的癌细胞的细胞生物学行为有无改变.结果 携带EGFP的逆转录病毒能有效地感染95D细胞,筛选出的细胞能稳定、高效、持久地表达EGFP,与未感染的细胞比较,他们的生物学特性未改变.结论 人高转移肺癌细胞株95D/GFP-1的建立为研究肺癌侵袭和转移的发生机制提供了理想的细胞株.     

睾丸特异性表达GFP小鼠的繁殖及其表型鉴定

目的 繁殖睾丸特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）小鼠,为进行小鼠生殖系统的研究提供有效的工具。方法 将Ddx4-cre转基因雄鼠与Rosa26mT/mG转基因雌鼠交配,通过Cre/loxP重组系统产生睾丸特异性表达GFP小鼠,利用分子、病理及活体成像的方法,从器官、细胞、分子水平上对该鼠进行表型鉴定。结果 分子水平的结果表明在这种小鼠的睾丸组织中发生了Cre酶介导的特异性基因重组;从器官水平上可以看到在这种小鼠的睾丸组织中具有GFP的表达;睾丸冰冻切片及精子荧光观察显示GFP主要表达于次级精母细胞、精子细胞和精子中。结论 睾丸特异性表达GFP小鼠繁殖成功。     

从噬菌体展示肽库中筛选与人精子蛋白17结合的短肽序列

目的：随机从噬菌体12肽库中筛选与人精子蛋白17（Sp17）特异性结合的短肽序列,并进行鉴定.方法：以基因工程制备的人Sp17为钓饵蛋白,采用亲和淘筛法对噬菌体肽库进行三轮亲和淘筛.富集Sp17特异结合噬菌体,用ELISA鉴定其结合活性并进行DNA测序分析.结果：随机挑出20个噬菌体克隆进行鉴定,ELISA显示其中5个克隆与Sp17有较强结合活性,其氨基酸序列分别为QLMSNIHRRMII、RKMMNQTKRHLP、NTMKTMRIMMTR、RRRLLLMQRRMKR和SPRPMMRRIRKQ.结论：从噬菌体展示肽库中筛选鉴定出5个与人Sp17结合的12肽序列.     

Establishment of Stable High Expression Cell Line with Green Fluorescent Protein and Resistance Genes

Mammalian expression systems have an undis-puted long-standing and very successful history forthe generation of recombinant proteins.While re-combinant proteins expressed in the cytoplasm ofbacteria are ofteninsoluble,inactive,soluble,andbioactive proteins can frequently be obtained fromeukaryotic cells.Furthermore,eukaryotic cellshave the capacity to carry out posttranslationalmodification,such as glycosylation,phosphoryla-tion ontyrosine,serine,andthreonine residues,orthe addition of fatty a…     

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法 微型角膜刀制作兔角膜基质瓣;转染组用含rAAV－EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,不同时间点(1、3、7、14、21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况,收集角膜,其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相,另一半固定后行HE染色。结果 转染组于转染第3天,体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达;7d达到高峰, 21d时仍有微弱表达。第7天 在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达。对照组角膜始终未见荧光表达。转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论 rAAV- EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞。为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。