小鼠肝细胞的分离培养

采用０．１％的胰蛋白酶消化乳小鼠肝组织块，用ＤＭＥＭ培养基进行肝细胞的培养，１周后可见细胞生长，３０ｄ左右细胞铺满培养瓶，培养的肝细胞能分泌白蛋白，培养第２０天白蛋白分泌量达高峰。     

小鼠肝细胞的分离培养

采用０．１％的胰蛋白酶消化乳化乳小鼠肝组织块，用ＤＭＥＭ２培养基进行肝细胞的培养，１周后可见细胞生长，３０ｄ左右细胞铺满培养瓶，培养的肝细胞能分泌白蛋白，培养第２０天白蛋白分泌量达高峰。     

日本血吸虫感染小鼠肝脏成纤维细胞的培养观察

报道小鼠感染日本血吸虫后肝脏成纤维细胞的体外培养及其形态学观察（光镜）。取感染后４２ｄ鼠肝经酶消化处理后,制备肝细胞悬液,经贴壁培养分离成纤维细胞。光镜下,培养中细胞多呈梭形、三角形、多角形外观,胞质突起较多,细长、透明,胞核一个,清晰可见。细胞增殖旺盛,可见明显分裂征象。     

大鼠传代培养肝细胞的形态学观察

目的 将大鼠肝细胞进行传代培养，并观察其形态学特点。方法 采用胶原酶二步法灌注1mo龄SD雄性大鼠肝脏，制备肝细胞悬液并进行原代及传代培养，对其形态学进行了观察。结果 肝细胞已传7代，每次传代培养6d左右，光镜下可见大量新生肝细胞生长，呈多边形，相嵌紧密排列。电镜下可见核变形，有的为双核细胞。此外，胞质内的糖原颗粒也逐渐减少。结论 成功进行了肝细胞的传代培养，为肝细胞的研究提供了一种方便的研究方法。     

日本血吸虫感染小鼠肝脏成纤维细胞的培养观察

报道小发鼠感染日本血吸虫后肝脏成纤维细胞的体外培养及其形态学观察。取感染后４２ｄ鼠肝经酶消化处理后,制备肝细胞悬液,经贴壁培养分离成纤维细胞。     

谷氨酸对培养神经元的兴奋毒性及氯胺酮的保护作用

对１６－１８ｄ胎龄的大鼠皮层细胞进行分离培养，观察过量谷氨酸对皮层神经元的影响以及氯胺酮的保护作用。表明；培养１０ｄ的神经元置于１０μｍｏｌ／Ｌ谷氨酸和低糖ＤＭＥＭ培养注中后，随着作用时间延长，乳酸脱氢酶性增加。     

大鼠自体静脉移植后内膜增生与平滑肌细胞增值

研究大鼠颈外静脉移植入颈总动脉后内膜增生（ＩＨ）的发病机制。应用组织切片的特殊染色，单克隆抗ＰＣＮＡ抗体及抗Ｄｍ的免疫组化方法观察Ｈ的发生过程。结果：①术后１ｄ移植静脉的内膜消失，术后２ｄ出现ＩＨ并逐渐增生，ＩＨ中可见大量平滑肌细胞（ＳＭＣ），术后１２周ＩＨ的面积与术后１８周无显著差异；②ＩＨ中ＳＭＣ的Ｄｍ呈阳性；③ＩＨ中ＳＭＣ的ＰＣＮＡ指数于术后２ｄ骤然升高，术后２周达高峰。结论：ＩＨ发生在移植     

内毒素及肿瘤坏死因子对肝细胞超微结构的影响

目的：研究内毒素及肿瘤坏死因子对肝细胞超微结构的影响。方法：我们采用胶原酶二步法灌注一月龄ＳＤ雄性大鼠肝脏,制备肝细胞悬液并进行了原代培养,重点研究了内毒素、肿瘤坏死因子对原代短期培养肝细胞超微结构的影响。结果：表现为糖原减少、溶酶体增多、线粒体肿大、嵴溶解、内质网扩张及断裂、甚至可见核空泡化、染色质消失。其中以肿瘤坏死因子引起的肝细胞损伤为重;若二者联合作用,则肝细胞受损更加严重。结论：内毒素与     

人胎肝细胞悬液的制备和应用

l人胎肝细胞悬液的制备 按照文献报道,首先选择母体肝功能正常,HBsAg阴性、康华氏反应阴性及无先天性遗传性疾病的孕妇,经水囊引产或剖腹产的胎龄4～6月正常新鲜胎儿,无菌条件下制备股肝细胞悬液.开始一段时间我室没有在胎肝细胞悬液中加入氯甲苯酸,经常发现悬液中出现肉眼可见的纤维蛋白聚合物,不论用何种物理方法如     

硫普罗宁对实验性肝损伤的保护作用

目的：观察硫普罗宁（ＭＰＧ）对小鼠实验性肝损伤的保护作用。方法：采用Ｄ－氨基半乳糖（ＤＡＧ）和乙醇（Ｅｔｈ）所致动物肝损伤的方法来研究ＭＰＧ的保肝作用。结果：ＭＰＧ灌胃剂量为１２５ｍｇ／ｋｇ·ｄ及２５０ｍｇ／ｋｇ·ｄ，对ＤＡＧ和Ｅｔｈ所致的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用。表现在ＭＰＧ能使血清中ＡＬＴ、ＡＳＴ明显降低，甘油三酯蓄积量减少，肝细胞变性坏死明显减轻。结论：ＭＰＧ具有防治由ＤＡＧ和Ｅｔｈ所致的肝损伤作用。     

兔视网膜色素上皮细胞的体外培养及超微结构研究

目的：将兔视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞进行体外培养,观察其超微结构。方法：用胰酶消化法培养兔ＲＰＥ细胞并传代。扫描电镜和透射电镜观察其超微结构。结果：原代培养的ＲＰＥ细胞含大量色素呈多角形,传代的细胞透明呈梭形。电镜显示它们具有细胞极性,含黑色素颗粒、各种细胞器、细胞间连接复合体,与体内一致。结论：培养的大量细胞可用于ＲＰＥ的体外实验研究。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞诱导条件的筛选

目的比较目前常用的诱导因素诱导MSCs分化为肝细胞的效果,以探讨大鼠骨髓MSCs向肝细胞方向分化的最佳诱导条件.方法无菌条件下取成年大鼠四肢骨骨髓分离出骨髓来源的间充质干细胞（marrowmesenchymal stemcells,MSCs）.在培养液中分别添加不同量的干细胞因子（SCF）、肝细胞生长因子（HGF）、成纤维生长因子-4（FGF-4）和不同组合的细胞因子以及不同量的肝细胞提取液,诱导MSCs向肝细胞方向分化,以未加任何诱导因素的培养液作为对照组,观察诱导细胞的形态学变化,并且应用生化检测诱导培养液上清中白蛋白和尿素的产生量,免疫组化检测分化后细胞的细胞角蛋白-18（CK18）的表达,并观察分化后细胞吲哚靛青绿（ICG）的摄入情况.结果诱导分化后的细胞呈圆形或多角形,类似肝细胞形态.未加任何诱导因素的培养细胞仍旧呈长梭形.不同用量的单一SCF、HGF和FGF-4、不同组合的细胞因子以及不同用量的肝细胞提取液均能诱导MSCs向肝细胞方向分化,但肝细胞提取液（1.0 mg/mL）组的诱导效果最佳.各诱导培养上清液中均有不同量的白蛋白和尿素的产生,诱导分化后细胞均见不同程度CK18的表达,并见分化后细胞不同程度的摄入ICG.未加任何诱导因素的细胞培养上清液中未见白蛋白和尿素产生,细胞不表达CK18,同时不能摄入ICG.结论细胞因子（SCF、HGF、FGF-4）和肝细胞提取液均能诱导MSCs向肝细胞方向分化,其中肝细胞提取液的诱导效果最佳.     

复方甘草酸苷在猪肝细胞悬浮培养中的应用

目的探讨复方甘草酸苷对体外悬浮培养肝细胞的保护作用。方法原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞,将分离所得猪肝细胞分为2组,复方甘草酸苷组培养基中含有800ug/mL的复方甘草酸苷,对照组为普通培养组,悬浮培养1周,观察形态和功能的变化。结果2组肝细胞培养12h后均形成多细胞球样聚集体,复方甘草酸酐培养组肝细胞成团更为明显;复方甘草酸苷培养组上清液ALB在培养后24h、3d、5d高于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）,在培养24h后,与培养后12h相比,复方甘草酸苷组ALB开始升高,普通培养组ALB开始降低,其后2组都开始升高,至7d时下降（P〈0.05）;2组肝细胞培养上清液BUN含量随培养时间延长逐渐升高,但2组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;2组肝细胞上清液中ALT含量逐渐下降,第3～7天复方甘草酸苷培养组组ALT含量低于单纯肝细胞培养组（P〈0.05）。结论复方甘草酸苷对体外悬浮培养的肝细胞具有保护作用。     

Restoration of cell polarity and bile excretion function of hepatocytes in sandwich-culture

Objective： To investigate the nature of the restoration of cell polarity and bile excretion function in Sandwich-cultured hepatocytes. Methods ： Freshly isolated hepatocytes from male Sprague-Dawley rats were cultured in a double layer collagen gel Sandwich configuration. Morphological changes were observed under a inverted microscope. The domain specific membrane associated protein DPP IV was tested by immunofluorescence, and the bile excretion function was determined by using fluorescein diacetate. Hepatocytes cultured on a single layer of collagen gel were taken as control. Results.. Adult rat hepatocytes cultured in a double layer collagen gel sandwich configuration regained its morphological and functional polarity and maintained polygonal morphology for at least 4 weeks. Immunofluorescence studies using antibodies against DPP IV showed polarity restoration as early as 48 h. After cultured in the double layer collagen gel Sandwich configuration for 96 h the hepatocytes began to excrete bile; while hepatocytes cultured on a single layer collagen gel had no bile excretion. Conclusion.. Hepatocytes cultured in a double layer collagen gel Sandwich configuration are able to regain their morphological and functional polarity given certain conditions. Hepaotcyte culture is a useful tool for the study of polarity restoration.     

新生猕猴肝脏上皮前体细胞无血清培养体系的建立

目的建立猕猴肝上皮前体细胞的无血清体外培养体系。方法取健康新生猕猴肝脏,剪切、消化、离心后在胶原培养体系中用含Ca^2＋的培养基培养,选取多角形细胞集落,在不同胞外基质中分离培养,应用细胞免疫荧光染色、细胞化学染色、RT—PCR、靛青绿吸收染色方法进行细胞表型和双向分化潜能鉴定。结果多角形细胞团块在层粘连蛋白或大鼠鼠尾胶原上增殖传代形成集落,并特异性地表达肝干细胞的特异性标志物,不表达成熟肝细胞标志。经地塞米松和抑瘤素诱导分化后表达成熟肝细胞的标志特征,在小鼠胎儿成纤维饲养层,表达胆管细胞的特异性标志蛋白并形成胆管样结构。结论利用无血清培养体系从新生猕猴肝组织中分离到具有肝前体细胞特性的多角上皮细胞,这一研究模型的建立可为人类肝脏疾病的研究和细胞治疗提供临床前的评估平台。     

Proliferation of retrorsine-treated SD rat immortalized hepatocytes after intrasplenic transplantation]

OBJECTIVE: To investigate the effect of retrorsine on the proliferation of SD rat immortalized hepatocytes after intrasplenic transplantation. METHODS: Immortalized hepatocytes from SD rats was prepared by transfecting the primary hepatocytes with a retroviral vector SSR69 expressing the genes encoding Simian virus 40 T large antigen. Twenty-four adult SD rats were randomly assigned to 3 equal groups designated respectively as A, B, and C groups. Intraperitoneal retrorsine injections at the dose of 26 mg/kg.b.w. were performed twice in groups A and B at the interval of two weeks before hepatocyte transplantation. After 20% hepatic lobe resection were completed in all the groups, groups A and C received intraplenic transplant with immortalized hepatocytes, while group B received normal hepatocyte transplant. Post-mortem examinations were performed on the spleen samples with HE staining. Albumin expression in the transplanted hepatocytes was examined by immunohistochemical staining, and the ultrastructure of the transplanted cells was observed under transmission electron microscope. RESULTS: Histological examination demonstrated that the rat spleens in all the 3 groups contained cluster of transplanted hepatocytes from 1 week to 3 weeks after the transplantation, and the proliferation of the transplanted cells were comparable between groups A and B, but both of which showed significant difference from group C. Albumin excretion by the immortalized hepatocyte was identified in all the groups, and the transplanted immortalized cells preserved normal cell ultrastructure. CONCLUSION: Immortalized hepatocytes of SD rat have the normal cell ultrastructure and albumin-excretion function, and retrorsine can promote the proliferation of the transplanted hepatocytes.     

建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化

目的:建立大鼠前庭器官的原代体外培养模型,并通过透射电镜观察前庭上皮细胞在佛波酯(PMA)作用前后的超微结构变化.方法:无菌条件下取出生2 d大鼠的椭圆囊上皮,体外培养1～7 d;从第2日开始用倒置显微镜观察、照相,试验组加入PMA 30 min,2 h和6 h,固定,透射电镜观察.结果:体外培养椭圆囊1 wk,12 h时可见成纤维细胞沿移植物边缘游出,2 d后内皮细胞聚集,呈铺路石样,透射电镜观察细胞无肿胀,胞膜、胞核完整,线粒体嵴无肿胀,纤毛无脱落;PMA各试验组细胞形态正常,核糖体密集,高尔基体较前发达,内质网轻度扩张.结论:大鼠前庭器官体外培养方法可行,为今后进一步研究提供了实验模型.     

形态学与形态计量学观察大豆异黄酮对前列腺增生大鼠的作用

目的观察与分析斑马鱼肝脏的显微和超微结构。方法光镜和透射电镜观察组织切片。结果斑马鱼肝脏没有典型的门管区,静脉和胆管随机地分布在肝实质中,很难观察到动脉。肝板由两层并列的肝细胞排列成双层板状结构,以中央静脉为中心呈放射状分布,在肝板（肝细胞索）之间是血窦,肝细胞索呈弯曲、分支和吻合状态,肝细胞核大而圆,核仁分区明显,核孔数目多,且密度大,呈现细胞代谢活跃旺盛的形态。胞质中粗面内质网（RER）既有管状结构也有扁平囊状结构,扁平囊状结构的RER呈区域化的层层排列,可达二十余层。线粒体成群分布,并且与RER紧密接触,为RER合成蛋白质提供能量。电镜观察发现当细胞质富含线粒体、RER、核糖体时,核孔的数目多,细胞质内出现一定量的溶酶体,糖原在细胞质内有少量的聚集。当细胞质内有大量的糖原分布时,则核孔的数目较少,且细胞嚣也较少。胆管系统在肝脏内呈树枝状分布,胆小管包括细胞内胆小管和细胞间胆小管,细胞内胆小管腔内的微绒毛明显多于细胞间胆小管。本文也对内皮细胞、贮脂细胞、红细胞和淋巴细胞进行了描述。并对斑马鱼肝脏的结构与其他硬骨鱼类进行了比较。结论斑马鱼肝细胞排列方式与其他硬骨鱼类有一定差异,也与前人的报道并不完全相同,这种差异和不同与动物种类和研究方法有一定关系。肝细胞的超微结构特征,在形态学角度证明了其活跃的合成和代谢功能。     

大鼠体外肝细胞集落的建立及生长调控研究

目的研究建立体外培养肝细胞集落的关键条件,探讨肝细胞克隆生长的调控机制。方法采用原位预灌流和胶原酶循环灌流分离肝细胞,观察在化学限定培养条件下,肝细胞生长素(HPN)、二甲亚砜(DMSO)及尼克酰胺(NA)对肝细胞DNA合成、有丝分裂象、光镜形态和电镜超微结构的影响。结果肝细胞培养时间进程显示:10 mmol/L NA显著协同HPN促进肝细胞3H-TdR掺入作用,在60和84 h出现2个DNA合成峰;2% DMSO抑制3H-TdR掺入,但在NA共同作用下,肝细胞在132 h表现为DNA合成峰。有丝分裂象显示:HPN NA DMSO培养72 h时肝细胞为正常二级分裂,168 h后仍保持相当的有丝分裂活性。光镜下形态及电镜超微结构观察到培养28 d的肝细胞克隆生长特征及增殖潜在性。结论NA及DMSO加入-移除方案可交叉控制HPN作用的肝细胞增殖,所构建的肝细胞克隆生长系统可用于人肝细胞代谢、诱变、细胞中毒及生物转化等研究,并为实施体外克隆肝细胞治疗肝衰竭及遗传性肝疾病提供实验依据。