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相似文献
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1.
目的:构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因(sta56)片段的重组表达质粒,在E.coli中表达Sta56重组抗原,重组抗原纯化后应用于间接法ELISA,金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体,方法:从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段,用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板,扩增出不同长度的截短的sta56片段,定向插入pPROEX HTb及pET30a载体,化大肠杆菌DH5a或BL21(DE3),IPTG诱导表达,应用SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况,应用Western blot分析重组抗原的活性;采用电洗脱,亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板,用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG,或以胶体金标记重组抗原,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体,结果:(1)从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF,并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO-sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342,各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,SDS-PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白,Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。(3)电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化,并获得高纯度的重组蛋白。(4)纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG,与间接免疫荧光法IFAT比较,其敏感性和特异性分别91.7%和76.5%。(5)纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法,可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较,其检测IgG的敏感性和特异性分别为94.2%和84.2%,结论:恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性,纯化后可用作免疫诊断抗原;以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG,适用于大规模的流行病学调查,以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体,具有简便,快速的特点,适于在缺乏实验条件的基层医院,农村对门诊病人进行诊断。  相似文献   

2.
目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体。方法:根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80%可产生高价的抗体。利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果:应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89.4%和79.6%,特异性分别为96.3%和93.9%。结论:高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断。  相似文献   

3.
目的 表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法.方法 参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列(AY376325)设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段.将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21( DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法.结果 成功克隆了prn全基因序列,并在E.coli BL21( DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性.应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法.试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1:40.结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础.  相似文献   

4.
为建立一种简便、快速诊断戊型肝炎病毒血清抗体的检测方法,以基因工程HEVORF2区重组蛋白抗原和人工会成HEVORF3区合成多肽抗原混合作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的单克隆抗人IgG抗体为第二抗体,建立了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中HEVIgG抗体技术。检测中国药品生物制品检定所《检测抗HEV抗体国家参考品》全套血清盘:特异性参比品30份,全部为阴性;阳性参比品10份,全部为阳性;精密性参比品,CV(n=10)<15%。17例非甲、乙、丙肝炎患者,黄殖出现后4个月内,HEVIgG抗体检出率为100%。普通人群HEVIgG抗体检出率为1%~2%。表明该方法检测HEVIgG抗体,特异性强、敏感性高、操作简便快速,适用于临床对戊型肝炎的诊断和流行病学调查。  相似文献   

5.
目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2/Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,间接酶联免疫附试验(ELISA)检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-/Ct+IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB/c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1:12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98.3%。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。  相似文献   

6.
目的制备猪带绦虫囊尾蚴rTS-CC18抗原并对其抗原性进行鉴定,为建立猪囊尾蚴检测技术提供诊断抗原。方法用PCR方法从重组质粒pGEM-TS-CC18中扩增TS-CC18编码基因,构建pET30a-TS-CC18重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导筛选高表达量菌株。采用Ni-FF亲和层析方法提纯表达蛋白。Western blotting及间接ELISA检测重组蛋白的反应活性。结果Tricine-SDS-PAGE表明,重组菌经0.5 mmol/LIPTG诱导6 h,可稳定表达可溶性rTS-CC18蛋白,其相对分子质量约16×103。Western blotting检测诱导的蛋白能与猪囊尾蚴阳性血清发生特异性反应;间接ELISA检测血清抗体结果表明:纯化的rTS-CC18蛋白与全囊虫抗原的相对特异性达100.0%,相对敏感性达84.0%,总符合率为94.3%。结论成功制备了猪囊尾蚴rTS-CC18抗原,其特异性、敏感性及稳定性良好,对诊断猪囊尾蚴病及开发诊断制剂具有潜在应用价值。  相似文献   

7.
脑肺吸虫病临床免疫诊断的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:为脑肺吸虫病的临床诊断提供简便、有效的方法。方法:采用斑点ELISA法与ELISA法对脑肺吸虫病人血清抗体的检测。结果:斑点ELISA法和ELISA法敏感性和特异性分别为96.7%、93.3%,无显著差异。对其他人群的检测交叉反应较低。结论:两种方法均可作为脑肺吸虫病的临床诊断,但比较显示,斑点ELISA法简便、快速,敏感性、特异性较高,更具临床实际应用价值。  相似文献   

8.
目的用间接ELISA法检测人弓形虫(TOXO)IgG抗体进行了优化改良,建立了快速法诊断TOXO-IgGELISA试剂盒。方法用自己生产的原材料采用间接ELISA法研制TOXO-IgG检测试剂,对随机选择的352份临床孕妇血清标本进行了检测,并与德国DIMATOXO-IgGELISA试剂进行比较。结果自制试剂盒敏感性、特异性和诊断指数分别为91.4%,94.6%和186.0%,两者符合率为94.3%。结论本试剂盒的质量与国外商品试剂相似,有较好的特异性和敏感性,可广泛应用于临床优生优育检测。  相似文献   

9.
目的表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列(AB020025)针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a(+)载体中,以E.coli BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。  相似文献   

10.
目的:调查海南岛立克次体的群别及其分布。方法:应用微量免疫荧光检测法(mIFA)对人群血清进行恙虫病、斑疹伤寒和斑点热3种立克次体IgM、IgC抗体检测。应用L929单层细胞进行立克次体分离培养。立克次体用特异性抗体进行mIFA鉴定。结果:恙虫病、斑疹伤寒和斑点热3种立克次体ISC抗体阳性率分别是13.55%(76/561),18.77%(101/538),30.83%(164/532)。其中IgM和IgC抗体均≥1:80者,斑疹伤寒为32.08%,斑点热为46.30%。立克次体分离培养结果,20份不明原因发热或疑似立克次体病患者血液标本分离出12株立克次体,免疫血清mIFA鉴定及聚合酶链反应(PCR)技术检测立克次体特异性DNA等方法鉴定出3株恙虫病立克次体、2株斑疹伤寒立克次体和7株斑点热群立克次体。结论:海南岛确有恙虫病、斑疹伤寒、斑点热病存在,该岛的中、西部感染率较高,南、北部较低。  相似文献   

11.
靖吉芳  张艳 《热带医学杂志》2013,13(5):631-633,667
目的获得重组幽门螺杆菌(H.pylori)脂蛋白(rLpp20),并研究其在血清学诊断中的应用价值。方法应用重组质粒pGEX-6P.2/Lpp20在大肠杆菌(E.coli)BL21中表达,并进行GST亲和层析纯化,用Western.blot检测纯化产物(rLpp20)的免疫反应性;以rLpp20为包被抗原建立ELISA法对200份患者血清标本进行特异性IgG抗体检测,并与幽门螺杆菌-IgG抗体检测试剂盒法进行比较。结果成功表达的rLpp20(43000Mr),纯化产物可被幽门螺杆菌多克隆抗体及阳性血清识别;成功建立了以rLpp20为包被抗原的间接ELISA法,其灵敏度为91.0%,特异度为100%。与试剂盒法比较,两者的符合率为95.5%。结论Lpp20具有良好的免疫反应性,能与幽门螺杆菌阳性血清特异性结合,有望应用于幽门螺杆菌血清学诊断。  相似文献   

12.
Objective Hepatitis Delt a Virus (HDV) antigen is widely used as a capture antigen in ELISAs for the identification of HDV infection;large amounts of recombinant HDV antigen with active antigenicity are required for this purpose.
Methods Reconstruct the gene of HDV antigen based on the bias code of Escherichia coli, the recombinant protein expresses by high-density fermentation with fed-batch feeding strategy, and purify by immobilized metal chromatography. The sensitivity and specificity of this antigen detect by ELISA method.
Results The expression of HDV antigen can reach 20%of the total cell mass in the soluble form. The recombinant HDV antigen can be conveniently purified (98%) by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) using the interaction between a His-tag and nickel ions. Production of recombinant HDV antigen can reach 0.5 g/L under conditions of high-density cell fermentation. Applied to the diagnostic ELISA method, the recombinant HDV antigen shows excellent sensitivity (97%for IgM and 100%for IgG) and specificity (100%for IgG and IgM) for the detection of anti-HDV antibodies.
Conclusion Expression and purification the recombinant HDV antigen as a candidate protein for application in a diagnostic ELISA for HDV infection. Large-scale production of the protein can be achieved using the high-density fermentation strategy.  相似文献   

13.
目的 建立基于登革病毒E蛋白特异性抗原的荧光素酶免疫吸附法(DENV-LISA),用于检测DENV IgG抗体。方法 分别构建DENV1-E1、DENV2-E2与荧光素酶的融合表达质粒,转染293T细胞后获得含特异性抗原与荧光素酶的融合蛋白,建立DENV-LISA,评价其特异度和灵敏度,并与商用登革病毒IgG抗体检测试剂盒比较。结果 DENV-LISA阳性检出率32.4%,特异度96.6%,商用检测试剂盒阳性检出率35.3%,差异无统计学意义(P>0.05);阳性样本稀释6400倍可判断阳性,灵敏度高;同批板间、板内检测值差异无统计学意义(P>0.05);重复性良好。结论 建立基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法,对登革病毒IgG抗体有较高特异度和灵敏度,可用于登革病毒感染的早期筛查、监测预警、流行病学调查等。  相似文献   

14.
目的:采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP-oc)多克隆抗体并鉴定其性能。方法:将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21(DE3)中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果:成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论:成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。  相似文献   

15.
本实验用12株经鉴定及增菌培养的幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori;HP)制成酸提取物作抗原,以ELISA间接法对101名患者进行血清HP-IgG检查,同时做细菌学检查,并以此作为金标准。检查结果显示62例患者血清HP-IgG阳性,阳性率达61.39%,与细菌学检查相比较,ELISA间接法检测HP感染的敏感性和特异性分别为:93.55%、89.74%。由此我们认为ELISA间接法检测HP抗体可用于HP感染的流行病学调查及大量标本的初筛检查。  相似文献   

16.
目的 探讨肾组织M型磷脂酶A2受体1(PLA2R1)抗原及其抗体在膜性肾病(MN)患者中的表达水平.方法 选取经肾活检证实的特发性MN(IMN)58例、乙型肝炎病毒相关性MN(HBV-MN) 15例、V型狼疮性肾炎(V-LN) 17例.采用间接免疫荧光法检测肾组织PLA2R1抗原,并与IgG4共定位.同时检测上述MN患者血清抗PLA2R1抗体.分析肾组织PLA2R1抗原及其抗体在MN中的表达差异,以及PLA2R1阳性与阴性患者临床资料的差异.结果 VLN及HBV-MN患者肾组织及血清中均未发现PLA2R1抗体;在81.03% IMN患者肾组织检测到PLA2R1抗原,70.69% IMN患者血清中检测到PLA2R1抗体,PLA2R1抗原与IgG4共定位,均沿肾小球毛细血管袢呈细颗粒状沉积.PLA2R1抗原阳性患者24 h尿蛋白定量高于阴性患者(P<0.05),并且血清清蛋白低于阴性患者(P<0.05).结论 肾组织PLA2R1抗原在IMN的诊断中敏感性及特异性均较高,且表达与临床病情严重性明显相关.  相似文献   

17.
本文报告用HRP—SpA染色法检测72例EHF病人和非EHF病人及健康人血清EHFIgG抗体滴度,结果表明本法特异性,敏感性与IFA法基本一致。本法操作简单,作者认为是一种实用的诊断流行性出血热的方法。  相似文献   

18.
目的 以CEA多表位融合蛋白为抗原,即ozlf-86/87融合蛋白,检测胃肠道肿瘤患者血清中抗CEA抗体,鉴定融合蛋白的抗原性,为融合蛋白作为诊断抗原提供依据,为下一步动物免疫反应实验奠定基础.方法 以CEA多表位融合蛋白作为诊断抗原,采用间接ELISA法,分别对收集的39例胃癌患者血清、25例结肠癌患者血清、30例慢性胃炎患者血清和30例健康对照者的血清中的抗CEA抗体进行检测,用方差检验分析胃结肠癌患者实验组和慢性胃炎、健康患者对照组血清抗体效价之间差异性.结果 胃癌和结肠癌实验组与对照组血清抗体效价之间差异均有统计学意义(P<0.01).对胃癌患者和结肠癌患者血清抗体的诊断敏感度分别为35.9%和44.0%,结论 本实验通过工程菌表达纯化的CEA多表位融合蛋白具有很好的抗原性,对用于血清学诊断的研究有一定的可行性,对制备ELISA血清检测试剂盒提供了理论基础,为下一步免疫反应及抗CEA抗体的制备奠定基础.  相似文献   

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