γ-氨基丁酸Rho2受体在神经母细胞瘤细胞中的稳定表达及其在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用

目的构建人γ-氨基丁酸(GABA) Rho2受体(GABRR2)真核表达载体,并转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立稳定表达细胞株,探讨GABRR2在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用。方法采用快速克隆方法将人脑组织GABRR2基因克隆至p IRES2-eGFP质粒,构建重组质粒p IRES2-eGFP-Rho2,利用X-fect试剂盒将其转染至SH-SY5Y细胞中,使用遗传霉素进行筛选,建立稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株。使用流式细胞术检测稳定转染过表达p IRES2-eGFP-Rho2的细胞,利用免疫荧光法鉴定稳定转染的SH-SY5Y细胞中p IRES2-eGFP-Rho2的表达。将野生型SH-SY5Y细胞分为A1、B1、C1组,稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞分为A2、B2、C2组,每组设3个平行孔,其中A1、A2组细胞使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)孵育,B1、B2组细胞使用含有谷氨酸盐的DMEM孵育,C1、C2组细胞使用含有谷氨酸盐和GABA的DMEM孵育,将各组细胞置于细胞培养箱中培养24 h,应用乳酸脱氢酶试剂盒检测各组细胞的存活率。结果重组真核表达载体构建正确,获得了稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的细胞株。A1、B1、C1组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=5. 542,P <0. 05);其中B1、C1组细胞存活率显著低于A1组(P <0. 05),C1组细胞存活率显著高于B1组(P <0. 05)。A2、B2、C2组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=6. 588,P <0. 05);其中B2、C2组细胞存活率显著低于A2组(P <0. 05),C2组细胞存活率显著高于B2组(P <0. 01)。A2组细胞存活率与A1组比较差异无统计学意义(P> 0. 05),B2组细胞存活率显著低于B1组(P <0. 05),C2组细胞存活率显著低于C1组(P <0. 05)。结论成功构建p IRES2-eGFP-Rho2真核表达载体,建立了稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株,为体外研究GABRR2的功能提供了实验基础,并证明使用GABA可缓解谷氨酸盐对细胞的损伤,为缺血性脑损伤的分子生物学治疗提供了靶点。     

甲型流感病毒DNA疫苗双表达载体的构建及表达

目的： 构建含有甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因的DNA疫苗双表达载体,为研究甲型通用流感疫苗奠定基础。方法： 将甲型流感病毒（H1N1）接种鸡胚后收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增M2基因;将微小病毒内部核糖体进入位点（IRES）基因插入到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将M2基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点,构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,酶切鉴定后测序;脂质体法转染COS7细胞并检测目的蛋白的表达。结果： 成功扩增出M2基因（约300 bp）、IRES基因(约580 bp)和GM-CSF基因(约400 bp),酶切鉴定结果表明构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,Western blotting检测证明流感病毒M2蛋白的表达。结论：成功构建出流感病毒DNA疫苗双表达载体pMIG。     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。     

重组共表达载体pSNAV2.0 HSV1tkIREShIL1Ra的构建及其在滑膜细胞中的表达

   目的引入内部核糖体进入位点（IRES）,构建HSV1 tk与hIL 1Ra双基因共表达AAV重组载体并检测其在滑膜细胞中的表达。方法PCR扩增HSV1 tk、IRES及hIL 1Ra基因片段,分别与pMD18 T simple载体连接,测序后,hIL 1Ra与HSV1 tk先后插入pMD IRES,构建重组质粒pMD HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切出HSV1 tk IRES hIL 1Ra片段,克隆至AAV载体质粒pSNAV2.0上,构建成重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切鉴定后,用脂质体转染上述质粒至原代骨关节炎（OA）滑膜细胞,RT PCR法鉴定共表达质粒在滑膜细胞中的表达。结果酶切鉴定证实重组共表达质粒构建正确;RT PCR检测到转染后的OA滑膜细胞中表达HSV1 tk与hIL 1Ra。结论成功构建了重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra;重组质粒转染OA滑膜细胞后,能表达HSV1 tk与hIL 1Ra。这为OA的基因治疗研究提供了理论依据。     

绿荧光蛋白的荧光强度在D-氨基酸氧化酶活性检测中的应用

目的 :探讨在转基因细胞KDfGc和KDfGd,以内部核糖体进入位点 (IRES)序列连接的绿荧光蛋白 (GFP)的荧光强度为单位 ,衡量D 氨基酸氧化酶 (DAAO)活性的准确性。　方法 :白血病细胞系K5 62e经转染含IRES序列连接的GFP和DAAO基因的逆转录病毒载体pLDfG ,获得稳定表达GFP和DAAO基因的单克隆细胞KDfGc和KDfGd,以流式细胞仪和Lowry测定其荧光阳性率以及平均荧光强度、蛋白量 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO 细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。　结果 :KDfGc和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .64%和 96.3 1%。 2× 10 4细胞的平均荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。 2× 10 4细胞的蛋白量分别为 13 .17μg和 7.12 μg ,KDfGc、KDfGd细胞每微克蛋白量每小时产生的H2 O2 峰值无差异 ,而以单位荧光来衡量 ,两细胞具有明显差别。　结论 :在含IRES序列的转基因细胞 ,以GFP的平均荧光强度为度量单位 ,比以细胞蛋白量能更准确地反映DAAO的活性。     

小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。     

肺癌中热休克转录因子2促进热休克蛋白的表达

目的 探讨HSF2通过促进热休克蛋白 (heat shock protein, HSP) 的表达对肺癌发生以及肿瘤细胞增殖的影响.方法 选取肺癌旁组织, 构建过表达HSF2真核载体 (p IRES2-EGFP-HSF2) , 分别转染BEAS-2B、A549, 检测其对细胞增殖及HSP表达的影响;转染p IRES2-EGFP-HSF2质粒的同时, 共转染HSP27、HSP90的si RNA, 检测其对细胞增殖的影响.结果 过表达HSF2可增加BEAS-2B和A549细胞增殖速度 (P<0.01) , 促进HSP27和HSP90的表达;转染HSP27、HSP90的si RNA均可减弱HSF2诱导的BEAS-2B和A549细胞增殖 (P<0.01) .结论 HSF2促进肺癌细胞增殖的作用可能主要是通过促进热休克蛋白的表达来实现.     

重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 体外构建携带报告基因胸腺嘧啶核苷激酶(TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)的重组质粒载体pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法 采用密度梯度离心法分离获得BMSCs,进行细胞免疫化学鉴定;应用PCR技术获得HSV1-TK、内部核糖体进入位点(IRES)、BDNF的cDNA序列,酶切后依次插入到pcDNA3.1的多克隆位点(MSC)中,酶切和序列分析鉴定;脂质体介导重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF转染BMSCs,RT-PCR和Western blot检测其目的 基因表达.结果 重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF经酶切和序列分析鉴定与预期设计一致;RT-PCR和Western blot检测证实TK和BDNF在IRES介导下可同时表达.结论 成功构建重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF并在BMSCs中有效表达,为下一步核素活体示踪转基因BMSCs治疗脑血管疾病奠定了实验基础.     

人B7-1、IFN-γ双顺反子逆转录病毒载体的构建和表达

目的 :制备免疫基因修饰的卵巢癌肿瘤疫苗。方法 :利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点 (internalribosomeentrysites,IRES) ,通过基因克隆技术构建人B7 1、IFN γ双顺反子逆转录病毒载体PLXSN/B7 1IFN γ。结果 :将PLXSN/B7 1IFN γ转染逆转录病毒包装细胞 ,包装成病毒 ,经滴度测定后 ,转导卵巢上皮癌细胞系 3AO ,筛选稳定表达克隆 ,RT PCR和免疫流式细胞测定均可证实B7 1、IFN γ在同一转导细胞的共表达。结论 :口蹄疫病毒的IRES可提供B7 1、IFN γ的共表达     

SPARCL1基因对肝癌SMMC-7721细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨富含半胱氨酸酸性分泌型糖蛋白类似物1(secreted protein acidic and rich in cysteines-like 1,SPARCL1)基因对肝癌SMMC-7721细胞增殖与凋亡的影响。方法:将肝癌SMMC-7721细胞随机分为5组,即空白对照组,p IRES2-Zs Green组,pIRES2-Zs Green-SPARCL1组,阴性siRNA组和SPARCL1 siRNA组,空白对照组不转染,其余4组分别转染p IRES2-Zs Green空质粒、pIRES2-Zs Green-SPARCL1、阴性siRNA及SPARCL1 siRNA;蛋白质印迹法检测SPARCL1蛋白表达,同时联合荧光显微镜检测转染效果;MTT法检测各组细胞增殖能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果:蛋白质印迹和荧光镜结果同时证实转染效果良好。MTT结果显示5组细胞抑制率差异有统计学意义(F=55.45,P<0.01),p IRES2-Zs Green-SPARCL1组增殖抑制率明显高于其余4组(P<0.05);SPARCL1 siRNA组细胞增殖抑制率低于其余4组(P<0.05)。流式细胞结果显示pIRES2-Zs Green-SPARCL1组凋亡率明显高于其余4组(P<0.05);SPARCL1 siRNA组凋亡率明显低于其余4组(P<0.05)。结论:过表达SPARCL1抑制肝癌细胞SMMC-7721生长和促进凋亡,沉默SPARCL1则反之。     

Expression of secreted alkaline phosphatase in hepatocytes controlled by HCV IRES]

OBJECTIVE: To establish a cell model of secreted alkaline phosphatase (SEAP) controlled by HCV internal ribosome entry site (IRES). METHODS: The fragment of HCV 5' noncoding region (5' NCR) was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and was immediately cloned the upstream of the SEAP gene of pSEAP2-Control, an SEAP eukaryotic expression plasmid. With the liposome transfection technique, the resulting recombinant plasmid pdNCRSEAP was transfected into hepatocytes QSG7710, and the SEAP activity of cell culture media was monitored quantitatively by the chemiluminescent method. The regulatory effect of the HCV 5' NCR on the SEAP expression was measured by the treatment of transfected cells with antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) at 5 mumol and 10 mumol, respectively. RESULTS: The light emission intensity of pdNCRSEAP expression was 76% that of pSEAP2-Control. The inhibition rates of pNCRSEAP luminescence intensity affected by ASODN of 5 mumol and 10 mumol were 29.2% and 44.6%, respectively, while ASODN had no significant effect on the pSEAP2-Control expression. CONCLUSION: The SEAP expression of pdNCRSEAP is controlled by HCV 5'NCR. The cell model of drug evaluation targeted at HCV 5'NCR is successfully established and can be analyzed conveniently.     

HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶基因在肝细胞中的表达

目的 :构建HCVIRES调控外分泌性碱性磷酸酶 (SEAP)基因表达的细胞模型。方法 :用PCR技术扩增HCV 5′NCR片段 ,定向克隆至表达质粒 pSEAP2 Control的SEAP基因上游 ,构建HCV 5′NCR调控SEAP表达的重组质粒 pdNCRSEAP。用脂质体基因转染技术 ,将pdNCRSEAP转染至肝细胞株QSG770 1。用化学发光法检测SEAP的表达 ,并观察不同浓度反义寡聚核苷酸 (ASODN)对SEAP表达的影响。结果 :重组质粒 pdNCRSEAP表达的发光强度为pSEAP2 Control的 76 %,5 μmol和 10 μmolASODN对pdNCRSEAP发光强度的抑制率分别为2 9.2 %和 44 .6 %,而对 pSEAP2 Control的SEAP表达无显著抑制作用 (P >0 .0 5 )结论 :重组质粒 pdNCRSEAP的SEAP表达受HCV 5′NCR调控 ,为以HCV 5′NCR为靶位点的药物评价建立了检测方便的细胞模型。     

HCV的检测方法

从发现丙型肝炎病毒以来 ,丙肝的检测技术发展迅速 ,灵敏度和特异性都有明显的提高 ,方法学在不断改进完善。笔者就近年来丙型肝炎的实验室检测方法作简要的综述     

Study of hepatitis C virus genotype in Guizhou area of southwestern China

OBJECTIVE: To determine the concordance in various hepatitis C (HCV) genotyping methods and to investigate the distribution of HCV genotypes in Guizhou area of Southwest China. METHODS: Serum samples from 206 patients (100 with chronic hepatitis and 106 with hemopathy) were detected for antibody of HCV by second generation enzyme-labelled immunosorbent assay (ELISA). Thirty-five anti-HCV positive samples were detected for HCV RNA by RT-polymerase chain reaction (PCR) and 30 HCV RNA positive samples were determined for their genotypes by three various genotyping methods [PCR with type-specific primers at the core region (primer-set), slot-blot hybridization with type-specific probes at NS5B region (blotting) and the restric fragment length polymorphism analysis of PCR products of 5' NC region (RFLP)]. Ten samples with the known genotype were analysed by the direct sequencing. RESULTS: Of 30 samples with positive HCV RNA, the types of 22 could be classified by three methods, and the genotypes determined by various methods had complete concordance. The types of 6 samples could be classified by two methods and 5 had agreement subtypes. The types of two samples could be classified only by RFLP. Overall, 27 (90.0%) had subtype 1b infection and 3 (10.0%) had subtype 2a infection. The nucleotide sequence of 8 samples with subtype 1b and one with subtype 2a were analysed by the direct sequencing. The subtypes determined by sequence analysis were in complete concordance with those decided by various genotyping methods. CONCLUSIONS: Subtype 1b is the predominent HCV genotype in Guizhou area, while subtype 2a is less common. There was a good concordance with the genotyping results obtained by various HCV genotyping methods.     

116例血清中HCV RNA定量检测与抗-HCV结果对比分析

目的探讨丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)和HCVRNA定量检测阳性结果对丙型肝炎诊断治疗的临床意义。方法采用第三代ELISA夹心法检测抗-HCV，荧光定量PCR法检测HCVRNA检测116例血清抗-HCV或HCVRNA阳性标本。结果在116例标本中，抗-HCV( )／HCVRNA( )双阳性者83例，抗-HCV( )／HCVRNA(-)者12例，抗-HCV(-)／HCVRNA( )者21例)。两者阳性符合率为71．6％(83／116)。在HCVRNA定量阳性结果中，则有104例为HCV感染，其中抗-HCV的阳性检出率为80．0％(83／104)。随着血清HCVRNA滴度的增高，抗-HCV的阳性率也增加，两者变化趋势一致。结论抗-HCV检测，HCVRNA荧光定量PCR法检测均有一定的局限性，同时应用抗-HCV和HCVRNA检测对临床上完善HCV诊断、评价抗病毒疗效更为准确。     

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的 比较TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒(HCV) RNA定量检测结果的影响.方法 收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息.分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCVRNA,qPCR检测提取HCV RNA的病毒载量,分析两种提取方法所得HCV RNA检测结果的差异.结果 qPCR结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性:y=0.978x+0.063(R2 =0.973).Bland-Altman统计分析显示TRIzol法提取的HCV RNA病毒载量对数值的平均值略低于磁珠法,但差异无统计学意义(P＞0.05).基因型分析结果显示1a、1b、2a、3a和6a基因型中两种提取方法差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 TRIzol法提取HCV RNA的定量检测结果和磁珠法相当,且成本低廉,可在国内广泛用于试剂盒的开发和HCV RNA临床检测.     

脑心肌炎病毒内部核蛋白体进入位点介导白介素-12基因在B16F1细胞中的表达

目的：研究脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的鼠白介素12(mIL-12)的p40和p35双亚基基因在同一启动子的调控下能否得以有效地表达并形成异二聚体p70。方法：采用脂质体法将表达经脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的p40和p35的质粒mEL-12／AD1-1转染B16F1细胞，连续3d收集并换细胞培养液，并检测其中的mIL-12(p70)量。结果：ELISA结果显示，mIL12(p70)的表达量随着时间推移逐步下降，由第1天的15．5ng／ml逐步下降到第3天的9．3ng／ml。表明mIL-12p40和p35双亚基基因得到有效的表达并加工形成了异二聚体p70。结论：脑心肌炎病毒的内部核蛋白体进入位点连接的双基因p40和p35在同一启动子的调控下得以同时表达。但其上游和下游的基因蛋白质翻译机制是不同的。     

肝炎肝硬化患者肝组织中HCV表达的初步探讨

目的:观察肝炎肝硬化患者肝组织中丙型肝炎病毒(HCV)的表达,探讨肝硬化患者肝组织中HCV的表达几率。方法:随机选取100例肝炎肝硬化患者进行肝活检。取肝组织,用免疫组化SP法,检测肝组织中的HCV。结果:100例肝炎肝硬化患者肝组织中,HCV阳性表达者10例,HCV检出率为10％。结论:结果表明,HCV是引起肝炎肝硬化的又一重要因素。