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核酶对2.2.15细胞中HBeAg表达抑制作用的初步观察 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:观察针对H了C区双位点核酶对2.2.15细胞中HBeAg表达的抑制作用。方法:利用亚克隆技术,从质粒pGEM-Rz123切下EcoR1-BamH1片段克隆于真核表达质料pBBS212中,将该质料转染2.2.15细胞,用ELISA及免疫组化方法观察该核酶对HBeAg合成的抑制作用。结果:细胞表达出针对HBV C区核酶,该核酶对HBeAg的抑制制达48.6%。结论:该双位点核酶可能通过针对HBV 相似文献
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丁型肝炎病毒基因组核酶的反式剪切活性 总被引:3,自引:1,他引:2
目的 观察丁型肝炎病毒2种基因组核酶(HDV genomic ribozyme,g Bz)是否存在式剪切活性。方法 合成g。.Rz74、g.Rz55的CDNA,克隆人质粒pGEM-4Z,体外转录获取核酶RNA,同时从质粒Rz277B上转嫌出同源性底物RNA,以β-32p-UTP标志,再将核酶与底物按比例混合,在一定条件下观察是否出现的剪切作用,结果 启动反应30min后,可以观察到的切产物,90m 相似文献
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目的 研究白细胞介素2(IL-2)基因对丙型肝炎病毒(HCV)E2基因免疫小鼠后效果的调节作用。方法 构建Ⅱ型HCV E2基因的真核表达载体p3E2,免疫组化法检测其在哺乳动物细胞中的表达情况。用p3E2单独或连同IL-2真核表达质粒一起对BALB/s小鼠进行尾部皮下注射,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测E2抗体的产生情况。结果 E2蛋白在哺乳动物细胞中得到瞬时表达。应用p3E2单独或连同IL 相似文献
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目的:确定人工设计的梅核Rx199对原癌基因K-ras mRNA的体外切割活性,为K-ras特异性核酶的体内应用提供依据。方法:利用DNA重组技术构建K-ras外显子1及核酶Rz199的体外转录质粒,以T7RNA聚合酶进行转录获得核酶Rz199对其靶RNA分子进行切割。结果:K-ras体外转录体为254nt的RNA分子,能被核酶Rz199切割成大小分别为90,164nt的2个片段。结论:梅核Ra1 相似文献
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目的:通过基因免疫诱导BALB/c小鼠产生抗Ⅲ型中国株HCV来源E2糖蛋白的体液免疫应答。方法:质粒p3W14在NIH3T3细胞中能够表达E2糖蛋白,纯化该质粒并用于BALB/c小鼠直接肌注,于加强注射后不同时相采血,以重组的E2糖蛋白检测特异性抗E2抗体。结果:接种p3W14质粒的小鼠中可检出抗E2抗体(5/6),抗体滴度1∶15~1∶120。结论:采用含E2/NS1基因的质粒DNA免疫,成功地诱导小鼠产生抗Ⅲ型株来源的E2抗体。 相似文献
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目的:通过基因免疫诱导BALB/c小鼠产生抗Ⅲ型中国株HCV来源F2糖蛋白的体液免疫应答,方法:质粒p3W14在NIH3T3细胞中能够表达E2糖蛋白,纯化该质粒并用于BALB/c小鼠直接肌注,于加强注射后不同时相采血,以重组的E2糖蛋白检测特异性抗E2抗体。结果;接种p3W14质粒的小鼠中检出抗E2抗体(5/6),抗体滴度1:15~1:120。结论;采用含E2/NS1基因的质粒DNA免疫,成功地诱 相似文献
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瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响 总被引:2,自引:2,他引:2
目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响. 相似文献
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双靶区反义RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究 总被引:12,自引:2,他引:10
目的 探讨表达乙型肝炎病毒(HBV)双靶区反义RNA的逆转录病毒载体对HBV复制和表达的影响。方法 用分子克隆法构建表达HBVX、P双靶区正、反义RNA的重组载体质粒,转染PA317细胞,用NIH3T3细胞扩增法检测假病毒颗粒滴度,以假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用酶标法检测其上清HBsAg和HBeAg,并以荧光聚合酶链反应定量方法检测2.2.15细胞内DNA和RNA含量。结果 HBVX、P双靶区反义RNA抗HBV的作用较单靶区反义RNA更明显,且对HBVS、C、P三个开放读码区的DNA和RNA抑制作用大,正义RNA无明显抑制作用。结论 细胞内表达HBV反义RNA具有明显抗HBV复制和表达的作用。双靶区反义RNA作用更明显。 相似文献
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目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物. 相似文献
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VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制 总被引:1,自引:0,他引:1
目的: 了解VP22融合型显性负性(DN)突变体对抑制乙肝病毒(HBV)复制的作用. 方法: 将VP22全长及其不同区段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端,克隆入pcDNA3.1(-)构成DN突变体真核表达质粒. 转染HepG2.2.15细胞后,免疫荧光鉴定DN突变体在细胞内的表达,并以培养上清HBV表面抗原(HBsAg)的浓度为指标,观察DN突变体对HBV病毒复制的抑制效应. 同时以MTT比色法观察转基因的表达对宿主细胞生长状态的影响. 结果: VP22及其不同区段构建的DN突变体可在HepG2.2.15细胞中进行表达,且对宿主细胞无毒性. VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV的复制,具有蛋白转导特性的DN突变体比无转导特性的DN突变体具有更强的抗病毒能力. 其中VP22全长构成的DN突变体具有最强的抑制效应,可使上清HBsAg浓度下降81.94%. 结论: VP22融合型DN突变体可以增强DN突变体对HBV复制的抑制. 相似文献
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c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用 总被引:4,自引:2,他引:2
目的:构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶(Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响。方法:计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构,选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因,以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体,以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后,通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体;核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导,转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs,经G418筛选出细胞克隆,流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果:核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体,DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确;经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体(pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆,扩大培养获得转染细胞;细胞周期分析显示,pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化,S期和G2/M期比率明显减少,细胞生长阻滞于G0/G1期,细胞增殖指数明显降低。结论:特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。 相似文献