原核生物的免疫系统和CRISPR基因编辑技术

CRISPR-Cas9技术是新近发展起来的一项基因编辑技术,是利用原核生物染色体DNA中的CRISPR片段以及与CRISPR片段紧密相邻的Cas基因产物的核酸内切酶作用而设计的一种基因编辑技术;该基因编辑技术除了可使基因失去功能即敲除基因外,还可以修正基因错误。CRISPR相关的基因编辑技术和此前的三种基因编辑技术(兆核酸酶基因编辑、锌指核酸酶基因编辑、转录激活样效应因子核酸酶基因编辑)相比,具有高效简单等诸多优点,是目前占绝对优势地位的基因编辑/基因敲除技术。在CRISPR-Cas9基因编辑技术的基础上,近年来又衍生出了几种新的基因编辑或沉默技术。本文对CRISPR系统的结构与功能、CRISPR-Cas 9基因组编辑技术和由其衍生的几种新技术作一综述。     

新一代基因编辑工具研究进展

目前,以核酸酶为主要成分的基因编辑工具已经成功实现可编程地对哺乳动物基因组进行靶向突变或插入删除,从锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）、CRISPR/Cas系统发展到更安全更精准的Cas9融合蛋白基因编辑工具和其他核酸酶基因编辑工具,本文系统阐述了基因编辑的发展演进历程、介绍了新一代基因编辑工具的开发与优化,针对基因编辑工具的临床应用与面临的挑战进行了展望。     

抗双胸蚓核酸酶EWD-2多克隆抗体的制备及鉴定

目的将从双胸蚓组织中纯化的核酸酶EWD2免疫新西兰大白兔制备兔抗EWD2多克隆抗体。方法将纯化的双胸蚓核酸酶EWD2免疫新西兰兔，制备兔抗EWD2血清，以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价。结果EWD2蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体。Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性，ELISA显示效价为1：6000。结论获得了双胸蚓核酸酶EWD2多抗血清，为今后对双胸蚓核酸酶活性和结构的研究建立了基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤耐药研究中的应用进展

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统是存在于细菌和古生细菌中的一种抵御外源DNA入侵的适应性免疫反应系统.与传统的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9操作更加简便、高效.目前,该技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用,包括乳腺癌和白血病耐药等诸多方面.CRISPR/Cas9技术的应用虽仍存在脱靶效应等问题,但其应用前景非常广阔.本文就其在肿瘤耐药研究方面的应用进行综述.     

线粒体基因编辑技术研究进展

线粒体DNA(mtDNA)突变会导致多种遗传病的发生。mtDNA编辑技术作为新兴的治疗手段基本基于蛋白质识别靶点，核酸识别型mtDNA编辑技术较少。以锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应核酸酶技术、碱基编辑技术为代表的蛋白质识别型mtDNA编辑技术取得了一定进展，但识别序列设计复杂的弊端阻碍其进一步推广。CRISPR/Cas9等核酸识别型编辑技术以其结构简单、易于设计和修饰的特色展现出优越性，但缺乏将核酸递送进入线粒体的有效手段限制了其在mtDNA编辑领域的应用。随着对内源性、外源性导入途径的研究和DNA修复机制的深化理解，越来越多的证据表明核酸递送的可行性和核酸识别型mtDNA编辑技术的广阔应用前景。本文基于识别元件分类，总结了当前线粒体基因编辑技术的原理和发展现状，展望了核酸识别型mtDNA编辑技术的潜在价值。     

CRISPR/Cas 基因组靶向编辑技术综述

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）是细菌特有的一种获得性免疫系统,研究人员将其改造成为靶向基因组编辑的工具,由于操作简单、成功率高且效率高,成为了靶向基因组编辑工具中的佼佼者。同时CRISPR/Cas系统也被改造作为一种极为有效的位点特异性的转录抑制/激活的工具而在研究工作中广泛应用,不仅如此,具有靶向细胞转录过程中产生的RNA底物的利用前景,从而起到与RNAi技术相类似的效果。 CRISPR-Cas技术已经在基因功能研究、动物模型建立、基因治疗等领域得到广泛的推广和应用,有力地推动了相关领域的研究进展。     

金荞麦对金黄色葡萄球菌胞外耐热核酸酶活性的影响

目的;观察金荞麦对金黄色葡萄球菌胞外耐核酸酶活性的影响。方法：采用甲苯胺蓝法,检测不同浓度金荞麦药液与该酶混和作用下该酶的酶环直径。结果：当金荞麦药液浓度为７．８ｍｇ／ｍｌ时即可明显影响胞外耐热核酸酶的酶环大小;至６２．５ｍｇ／ｍｌ时,已无酶环出现。结论;金荞麦能明显抑制金黄色葡萄球菌胞外耐热核酸酶的活性。     

耐热核酸酶快速鉴定金黄色葡萄球菌

耐热核酸酶试验快速鉴定金黄色葡萄球菌,可缩短鉴定时间。将标本接种于肉汤培养基中,取肉汤培养基经加热处理后加入脱氧核糖核酸(DNA)板上。TNase一旦呈阳性反应,不会再转为阴性,且易判断,TNase试验很适合临床应用。     

RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的应用价值

RNA干扰（RNAi）是一种在动植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程。它由双链DNA经核酸酶降解成21～23nt的小片段后，特定位点、特定序列的降解与之序列相应的mRNA。利用RNAi技术可作为一种基因敲除工具应用于多种疾病的治疗，尤其在肿瘤的基因治疗中有着广泛的应用前景和价值。     

葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究

为获得纯度较高的葡萄球菌核酸酶(SNase)以研究其与糖尿病的关系,构建基因工程表达菌E.coli BL21/pET28a-His-SNase,诱导其表达可溶性胞外蛋白,并对纯化的SNase进行初步性质研究。采用分子生物学方法设计和构建含有SNase基因的表达载体pET28a-His-SNase,再转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞。经过乳糖诱导表达、超声破碎及镍柱亲和色谱等纯化步骤后,以SDS-PAGE和Western blot鉴定His-SNase,并对其性质进行了初步研究。结果表明,乳糖诱导后His-SNase能高效表达,亲和色谱后纯度高达85%以上,且其具备较高的核酸酶活性,作用pH范围较广,有很好的耐热性。本研究为进一步探究葡萄球菌核酸酶与糖尿病的关系奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统在现代生物学研究和临床试验中的应用

 规律成簇间隔短回文重复结构(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protien 9,Cas9)系统在生物医学研究中被广泛应用于基因编辑及探索基因的功能。这种基因编辑技术越来越多地运用在人类疾病的治疗中,包括巴斯综合征、杜氏肌萎缩症、血友病、地中海贫血和囊性纤维化。CRISPR/Cas 9基因编辑系统可以在体外细胞实验和体内动物实验上修复突变的DNA序列,也能改变 CCR5、PD-1/L1、CAR-T等基因序列,用于控制 HIV病毒的入侵及提高肿瘤免疫治疗的疗效。该技术还被运用于诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)分化,形成某些具有功能的器官用于器官移植。本文综述了CRISPR/Cas 9系统的来源、结构和作用原理,以及其在现代生物学研究和基因治疗领域的应用。     

利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系

目的 采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术构建叉头框G1（FOXG1）基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA（gRNA）诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6（PAX6）、性别决定区Y框蛋白2（SOX2）和正小齿同源物2（OTX2）的表达。结果 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论 通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。     

用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sgKLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响.方法 设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pX459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性.将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力.结果 经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒pX459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强.结论 成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性.     

CRISPR/Cas9 系统：构建非人灵长类动物疾病模型的新技术

动物疾病模型在研究人类疾病致病机理和药物筛选中起到了关键作用。非人灵长类动物由于与人类更为接近,在探究人类神经退行性疾病、神经精神疾病及人类认知功能、神经环路等方面具有巨大的优势可成为研究和药物筛选的重要疾病模型。然而,由于缺乏大动物的胚胎干细胞系,传统的基因打靶技术难于用来建立灵长类动物疾病模型。最近发展的基因编辑新技术 CRISPR /Cas9系统在定向对基因进行修饰上展现出了巨大的潜力。本文将介绍 CRISPR /Cas9技术的发展和应用,以及非灵长类动物作为神经退行性疾病模型的优势和意义。     

基于CRISPR-Cas9定向编辑TRAC基因的研究

目的 针对人源TCRα C基因(TRAC)进行CRISPR/Cas9-gRNA的设计,并验证设计的gRNA的有效性及其脱靶率.方法 利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRα C区各设计出了3个编辑位点,并据此构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,将构建好的质粒转染293T细胞系,通过流式细胞术结合PCR产物的T-A克隆测序等方法验证各个gRNA序列的编辑效率.再根据所预测的潜在脱靶位点,设计相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否出现脱靶.结果 在3组针对TCRα C区的gRNA中,site2-gRNA的编辑效率最高,并且无脱靶现象.结论 针对人源TCRα C基因设计的site2-gRNA对TCRα C区具有很好的编辑效果,且无脱靶现象,为消除杂合TCR分子的产生和改善TCR修饰的T细胞(TCR-T)过继性免疫治疗奠定了基础.     

应用CRISPR/Cas9技术构建IL-15敲除的MGC-803胃癌细胞株

目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立IL-15基因敲除的MGC-803胃癌细胞株?方法:针对IL-15基因作用的功能域,设计了靶向IL-15基因Exon2的gRNA? 构建PX458-gRNA重组质粒并转化感受态细胞Stbl3,筛选出重组子后进行测序,通过测序确认了所设计的gRNA的有效性?并进一步通过流式细胞分选以及ELISA法检测筛选出的MGC-803胃癌细胞株IL-15基因的表达水平?结果:测序结果显示敲除质粒构建成功,与阴性对照组相比,转染PX458-IL-15-gRNA质粒组IL-15的表达水平明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P < 0.001)?结论:利用CRISPR-Cas9系统成功构建了IL-15基因敲除的MGC-803 细胞,为后续研究IL-15在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础?     

CRISPR/Cas9系统构建ROCK2基因敲除肺癌细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9编辑系统对人肺癌细胞系A549、H460细胞中Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)基因进行稳定敲除,并对其敲除效果进行验证。初步探讨ROCK2基因敲除肺癌细胞株的细胞水平上的功能改变。方法 利用Rock-2 CRISPR 质粒和Rock-2 HDR 质粒转染构建A549、H460 ROCK2基因敲除稳定细胞株。蛋白质印迹法验证敲除效果、用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ROCK2基因的mRNA表达水平。平板克隆形成实验、MTT法检测各细胞株的增殖能力。结果 A549、H460肺癌细胞中ROCK2基因稳定敲除株构建成功。与原始细胞株相比,ROCK2敲除株细胞中的蛋白表达水平完全缺失,细胞内的mRNA表达水平显著下降,而且能降低A549、H460肺癌细胞的增殖能力。结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得ROCK2基因敲除的肺癌细胞系,为进一步研究ROCK2对肺癌生长的影响奠定基础。