人载脂蛋白M野生型和突变型表达载体的构建及鉴定

目的: 构建人载脂蛋白M (APoM)野生型和突变型原核表达载体PGEX-KG-APoM及真核表达载体PcDNA3.1(+)-APoM。方法: Trizol法抽提HePG2细胞总RNA,RT-PCR扩增APoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T质粒中构建PMD18-T-APoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定。采用Sited-directedMutagenesis定点诱变试剂盒对APoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否。用双酶切方法分别将APoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体PcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型PGEX-KGAPoM重组体和PcDNA3.1(+)-APoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定。结果: 成功克隆了APoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体。结论: 通过RT-PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒PGEX-KG-APoM和PcDNA3.1(+)-APoM,为进一步研究APoM的功能奠定了基础。     

野生型及突变型人血管内皮生长因子A真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建人野生型和c.454CT突变型血管内皮生长因子A(VEGFA)真核表达载体。方法:采用反转录聚合酶链反应扩增人VEGFA基因,用限制性核酸内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切后连接真核表达载体pEGFP-N1,构建野生型VEGFA真核表达载体(野生型pEGFP-VEGFA),通过双酶切和测序进行鉴定。采用定点诱变PCR技术构建c.454CT突变型人VEGFA真核表达载体(突变型pEGFP-VEGFA),同样通过双酶切和测序进行鉴定。结果:野生型和突变型pEGFP-VEGFA被双酶切为4 697 bp和1 251 bp两条条带。测序结果证实野生型pEGFP-VEGFA VEGFA序列与GenBank公布的VEGFA mRNA序列完全一致,突变型pEGFP-VEGFA除第454位碱基C被T替代以外,其余序列与野生型完全一致。结论:成功构建了野生型和突变型pEGFP-VEGFA,为下一步研究VEGFA基因功能提供参考。     

野生型及突变型α-synuclein转基因表达载体的构建

目的构建中枢神经系统特异表达的野生型及突变型α-synuclein转基因表达载体.方法通过PCR方法扩增α-synuclein基因,产物亚克隆到pGEM-T载体,经测序无误后克隆到pCEP4载体,并用神经特异的PDGF启动子替代pCEP4载体的CMV启动子构建野生型转基因表达载体.利用大引物突变法构建A53T和A30P的转基因表达载体.结果通过限制性内切酶及DNA测序证实野生型及突变型α-synuclein均成功的克隆到所需要的载体中.结论该转基因表达载体的成功构建为帕金森氏病转基因动物的构建及帕金森氏病发病机制的研究奠定基础.     

人3突变型低氧诱导因子1 α真核表达载体和腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的为了深入研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用,构建人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。方法双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,凝胶回收前者酶切片段中大小为300bp的小片段及后者酶切片段中大小为6300bp的大片段,并将两者连接,重组成3突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803,并进行酶切和PCR鉴定。鉴定正确后,采用分子克隆技术,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组3突变型穿梭载体,获得含有3突变型HIF-1α(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架载体Adeno-XTM Viral DNA连接,重组成3突变型腺病毒载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803),再进行酶切及测序鉴定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组3突变型真核表达载体和腺病毒表达载体质粒构建成功。结论成功构建重组人3突变型低氧诱导因子1α真核表达载体(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)和人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。     

人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala 564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564。方法 采用分子克隆技术,在业已完成的pShuttle2-HIF-1α—Ala564的基础上,用连续聚合酶链式反应（PCR）定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α—Ala402-Ala564。结果 经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564构建成功。结论 成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564,为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础。     

人三突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的：为了深人研究人低氧诱导因子1α（HIF-1α）基因对冠心病患者的血管新生作用，构建人三突变型HIF-1α真核表达载体（pShuttle2-HIF-1α-A1a4O2-Ala564-Ala803）。方法：双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-A1a564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803，胶回收前者酶切片段中300bp的小片段及后者6300bp的大片段，并将两者连接，重组成三突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，并进行酶切和PCR鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组三突变型穿梭质粒构建成功。结论：成功构建重组人三突变型HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，为进一步促进基因治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

野生型及突变型survivin基因重组逆转录病毒的构建及表达研究

目的构建含绿色荧光蛋白和野生型及第34位氨基酸突变型survivin基因的双顺反子逆转录病毒载体,并进行真核细胞表达.方法用PCR的方法由含survivin基因的真核表达载体扩增所需目的片段,然后将该片段插入逆转录病毒载体pMIG.酶切鉴定重组子,脂质体介导下转染包装细胞Phoenix E,病毒上清感染NIH3T3细胞,RT-PCR检测外源基因mRNA的表达、流式细胞仪检测GFP的表达从而确认外源基因的转录.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,目的片段成功的连接到pMIG载体上.载体转染NIH3T3细胞,RT-PCR显示目的片段mRNA能够表达,流式细胞仪检测GFP获良好的表达.结论成功构建了人survivin基因野生型及突变型逆转录病毒,并在NIH3T3细胞进行了表达,为下一步的研究工作提供了有效的分子工具,并且为将来能在体内应用抑制survivin基因表达的肿瘤治疗奠定基础.     

人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1( )-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.     

突变型pAAV-CD151真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建CD151两种突变体,为研究CD151的功能及CD151-整合素复合体的功能奠定基础.方法 以pAAV-CD151质粒为模板,采用定点突变技术,构建整合素α3β1/α6β1结合缺陷QRD突变体(pAAV-CD151-QRD-AAA~(194-196)突变体)和CD151囊泡运输基序缺陷的ARSA突变体(pAAV-CD151-YRSL-ARSA~(245-248)突变体),并包装两种突变体的重组腺相关病毒.结果 经过测序鉴定成功构建了CD151的QRD和ARSA突变体,亦成功包装了重组腺相关病毒,病毒滴度符合本实验要求.结论 成功构建CD151两种突变体并包装成重组腺相关病毒,为进一步研究CD151的功能和作用机制奠定了基础.     

野生型抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建野生型PTEN基因真核表达载体pcDNA3.0-PTEN,并进行鉴定.方法：参照野生型PTEN基因mRNA全序列,在cDNA两端各设计一条对应引物,并引入各自的酶切位点.从正常人外周血淋巴细胞中提取mRNA作为模板合成PTEN cDNA第一链,并扩增目的基因全表达序列片段,经双酶切后定向克隆至pcDNA3.0真核表达载体中,蓝白斑试验筛选阳性重组质粒.分别经双酶切、特异PCR及测序法对重组质粒进行鉴定.结果：双酶切和特异PCR结果表明克隆的基因片段约为1.2 kb;测序法进一步证实该基因为野生型PTEN编码基因,经NC-BI BLAST分析与GenBank中PTEN基因序列同源性为99.92%,编码的氨基酸同源性为100%.结论：成功构建了PTEN真核表达载体pcDNA3.0-PTEN,为研究PTEN在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a( )原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体。方法采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a( ),通过两次定点诱变得到pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度。结果经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1∶100000。结论成功构建pET28a( )-野生型LPL及pET28a( )-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础。     

野生型人LPL及联合突变体原核表达载体构建及抗体制备

目的 构建野生型人脂蛋白脂酶(LPL)和联合突变体的pET28a(+)原核表达载体,蛋白纯化后制备突变型多克隆抗体.方法 采用RT-PCR技术从人肾周脂肪组织中获得野生型LPLcDNA,酶切和测序鉴定后插入原核表达载体pET28a(+),通过两次定点诱变得到pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,酶切和测序鉴定后分别转染大肠杆菌BL21.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳分析;镍柱亲和层析纯化,Western blotting鉴定;将纯化后的突变型LPL蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting检测血清突变型多克隆抗体滴度.结果 经酶切和测序鉴定,所构建的野生型LPL及联合突变LPL的基因片段正确;两种重组质粒转染大肠杆菌BL21后,均呈高效表达;SDS-PAGE电泳分析及Western blotting鉴定表明,诱导纯化后的蛋白为目的 蛋白;兔抗突变型LPL的多克隆抗体滴度达1:100 000.结论 成功构建pET28a(+)-野生型LPL及pET28a(+)-Asn291Ser和Lys312inC联合突变LPL,同时利用获得的高纯度蛋白制备了高效价突变型LPL多克隆抗体,为进一步进行野生型LPL和突变型LPL蛋白的体内试验奠定了基础.     

野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1真核表达载体的构建及其在小鼠足细胞中的表达

目的 构建野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1(dynactin-1)真核表达载体,并观察其在小鼠足细胞中表达。方法 以总RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增得到小鼠dynactin-1的全长cDNA,将该片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)-FLAG和pEGFP-N1;利用部位特异性突变插入方法构建突变型表达载体,经酶切和测序鉴定;各载体转染小鼠足细胞MPC5后,用蛋白质印迹分析法和免疫荧光显微镜法检测dynactin-1蛋白表达。结果 PCR扩增得到大小为3.8 kb的小鼠dynactin-1片段,连接到载体后,酶切鉴定电泳结果分别显示pcDNA3.1(+)-FLAG(5.4 kb)、pEGFP-N1(4.7 kb)以及小鼠dynactin-1(3.8 kb)片段,测序分析结果 显示克隆的野生型和突变型小鼠dynactin-1序列与数据库序列相同;蛋白质印迹分析法检测到重组dynactin-1的蛋白条带;免疫荧光显微镜观察到dynactin-1主要表达在小鼠足细胞的细胞质。 结论 成功构建了野生型和突变型小鼠dynactin-1真核表达载体,并在足细胞中表达,为进一步开展细胞生物学研究奠定了实验基础。     

抗突变型p53 Maxizyme的体外转录和真核表达载体的构建及鉴定

目的 :构建抗突变型p53Maxizyme(Mz)的体外转录和真核表达载体 ,为进一步探讨抗p53Mz的体外切割作用和在细胞内对突变型 p53的抑制作用打下了基础。 方法 :应用计算机设计针对肝癌细胞突变型 p53(mtp53) 2 4 9位密码子的Mz的基因片断 (MzL和MzR) ,分别克隆入体外转录载体 pBSKU6中 ,命名为 pU6 -MzL和pU6MzR。应用PCR技术使 pU6 -MzR的酶切位点改变 ,亚克隆入 pU6 -MzL中 ,重组质粒命名为pU6 -Mz,同时构建靶基因mtp53的体外转录质粒 .再将嵌U6中的Mz亚克隆入真核表达载体 pEGFP中 ,构建真核重组质粒pEGFP -Mz ,该质粒嵌于U6表达系统中 ,在体外由RNA聚合酶Ⅲ高效转录。结果 :测序结果提示成功构建了Mz的体外转录和真核表达载体。结论 :本研究成功构建了针对突变型p53的Maxizyme的体外转录和真核表达载体 ,为进一步的体外实验和细胞内的研究打下了基础     

人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定

目的：构建人Smad3的shRNA表达载体，运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响．方法：化学合成针对人smad3基因的dsRNA，瞬时转染入Hela细胞，检测RNA干扰效果，筛选有效干扰靶位点；设计并合成针对人smad3基因的siRNA寡核苷酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencer^TM3．1-H1hygro，转染入Hela细胞，用hygromycinB筛选稳定单克隆细胞株，对细胞株行RT-PCR和Western Blot检测，观察siRNA对靶基因的抑制效果，进一步研究下调目的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化．结果：瞬时转染筛选到了有效的RNA干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆细胞株，smad3mRNA和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制．结论：成功构建了针对人Smad3高效、特异、作用持久的shRNA表达载体，转染细胞后可下调Smad3的表达，为进一步研究smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础．     

人双突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人双突变型HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒表达载体,研究人双突变型低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用.方法 在业已完成的pShuttle2-HIF-1α-Ala564的基础上,用PCR定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-lα-Ala402-Ala564,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒连接,重组成pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为重组Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564腺病毒.结果 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功.结论 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF-1α-Ala402-Ala564(双突变型),为冠心病的突变型HIF-1α基因治疗研究奠定基础.     

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。     

携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack- PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。     

人载脂蛋白M的表达与纯化

目的:表达人细胞外全长结构域重组人载脂蛋白M(apolipoprotein M,ApoM)并将其纯化.方法:利用人类肝脏cDNA文库做模板,聚合酶链反应(PCR)法扩增ApoM DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pGEXT相应住点,插入E.coli JM109,转化E.coli DL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达.结果:PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实在SDS-PAGE上出现一条560bp的基因片段.测序结果与GenBank公布的人ApoM基因序列完全一致.ApoM cDNA基因片段经IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子量24 kD左右出现新的蛋白条带.结论:成功克隆出人ApoM基因,重组表达出ApoM蛋白.     

突变型人PRKAG2基因的克隆及其真核表达载体构建

目的 构建含有突变位点R302Q的PRKAG2的真核表达载体.方法 首先通过RT-PCR获得人PRKAG2的基因序列,然后采用PCR定点突变获得含有R302Q的PRKAG2基因序列,最后通过酶切连接至真核表达载体pIRES2-EGFP中.结果 通过RT-PCR获得的人PRKAG2的编码区序列1710 bp,经测序比对与NCBI公布的序列完全一致,通过PCR定点突变拼接900 bp和800 bp片段获得了含有R302Q突变位点的PRKAG2,酶切连接至pIRES2-EGFP载体中,经菌落PCR筛选和酶切验证获得阳性克隆pR302Q-IRES2-EGFP,经测序验证与预期完全一致.结论 构建含定点突变人PRKAG2基因重组载体pR302Q-IRES-EGFP为进一步研究基因PRKAG2 R302Q突变体的功能奠定了基础.