靶向肿瘤血管磁共振对比剂的制备及体外显像研究

目的制备针对肿瘤新生血管的靶向纳米磁共振(MR)对比剂,并用高场强MR检测其体外显像能力。方法通过碳二亚胺法将超小型超顺磁性氧化铁(USPIO)与环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽连接。普鲁士蓝染色检测环RGD肽-超小型超顺磁性氧化铁复合物(RGD-USPIO)针对整合素αvβ3的特异性及靶向性。原子吸收分光光度计检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对RGD-USPIO的摄取量变化。透射电镜检测RGD-USPIO的亚细胞定位。4.7 T MR检测不同时间梯度HUVEC摄取RGD-USPIO及单纯USPIO引起MR T2值的变化。结果 RGD-USPIO可特异性结合αvβ3,具有良好的靶向性,HUVEC摄取的RGD-USPIO主要位于细胞内,并可引起MR T2信号强度明显下降,与USPIO组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RGD-USPIO可特异性地与高表达整合素αvβ3的HUVEC结合,明显降低高场强MR T2值,是一种具有前景的靶向MR对比剂。     

非RGD肽超微超顺磁氧化铁探针制备及对人脐静脉内皮细胞的靶向作用

目的：构建非RGD肽超微超顺磁氧化铁（USPIO）分子探针,探讨其对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的靶向作用。方法: 采用化学交联法将非RGD肽(命名为P1c)偶联于二巯基丁二酸(DMSA)修饰的USPIO,形成具有免疫活性的分子探针。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测探针对 HUVEC 增殖的影响。USPIO 标记的 P1c 肽作为实验组,USPIO 为对照组,通过固相结合实验、普鲁士蓝染色分析其体外免疫学特性,采用 1.5 T 磁共振仪对探针与高表达整合素 α_vβ₃的 HUVEC进行体外细胞成像。结果: 成功构建 USPIO 标记的 P1c 肽分子探针,其对 HUVEC 增殖无明显影响。固相结合实验及普鲁士蓝染色证实该探针能特异性与整合素 α_vβ₃结合。体外 MRI 显示在同一铁质量浓度时,P1c-USPIO 与 HUVEC 孵育后较 USPIO 组 T2*值明显缩短。结论：化学交联法可成功制备 P1c肽USPIO分子探针,该分子探针具有良好免疫学活性,可特异性结合整合素 αvβ3分子。     

整合素β3亚基真核表达载体的构建及αvβ3的表达

目的：构建人整合素β3亚基真核表达载体，并探讨如何使人整合素αvβ3在CHO细胞表面有效表达．方法：构建编码人整合素β3真核表达载体pcDNA3．1-β3；将其与编码人整合素αv亚基真核表达载体分别及共转染至中国仓鼠卵巢(China hamster ovary，CHO)细胞中进行表达；采用间接免疫荧光法(IFA)检测外源基因的表达．结果：共转染组目的蛋白呈高效的细胞膜表达；pcDNA3．1-β3单独转染组β3亚基细胞膜表达较共转染组弱；而pcDNA3-αv单独转染组则未见有效的细胞膜表达．结论：人整合素αvβ3在CH0细胞表面的有效表达需要2个亚基共同参与。     

不同表面修饰的Fe3O4纳米颗粒在体肿瘤成像研究

目的:比较两种不同表面修饰的Fe3O4纳米颗粒作为肿瘤探针进行在体磁共振成像(MRI)的区别。方法:采用两种不同表面修饰的Fe3O4作为磁共振造影剂,并利用其表面羧基与具有靶向识别肿瘤表面整合素受体(Integrinαvβ3)的c(RGDyK)多肽进行耦联,制备出具有肿瘤靶向性的磁共振分子探针。以荷人脑胶质瘤(U-87 MG)裸鼠为动物模型,进行体内MRI研究。结果与结论:两种纳米颗粒均能够产生明显的T2造影效果,表面为聚乙二醇及油胺共同修饰的纳米颗粒的最佳成像时间为注射药物后8 h,而只有聚乙二醇修饰的纳米颗粒的最佳成像时间为注射药物后4 h,导致两种纳米颗粒在成像时达到最佳成像效果的时间不同的原因在于其表面电荷的不同。     

超顺磁性纳米氧化铁颗粒淋巴结成像及其与病理超微结构的比较

目的 研究不同性质淋巴结超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)的增强磁共振特征,探讨其与淋巴结超微结构的关系.方法 36只健康新西兰兔随机分为炎症组及肿瘤转移组,兔足垫注射完全弗氏佐剂,用于建立腘窝淋巴结的炎性增生模型;兔后小腿肌肉接种VX2 瘤株,用于建立腘窝肿瘤淋巴结转移模型.两组建模后动物均经静脉注射90 μmol Fe/kg的USPIO,于注射前及注射后24 h分别行磁共振成像(MRI)扫描观察淋巴结信号强度及T2值变化并计算强化率,扫描后取出腘窝淋巴结行HE染色、普鲁士蓝染色及电镜切片,观察淋巴结超微结构的变化、铁颗粒在淋巴结内的分布特征,分析病理显微结构与淋巴结强化的关系.结果 炎症组36枚淋巴结表现为不同程度的反应性增生,肿瘤转移组共26枚淋巴结为肿瘤转移性.平扫时炎性增生的淋巴结和肿瘤转移性淋巴结的T2信号强度差异无显著性,USPIO强化后,炎性增生淋巴结中心T2信号强度明显降低,肿瘤转移淋巴结则表现为均匀而不明显的T2信号下降,二者淋巴结强化率分别为57.39%和29.45%,差异具有显著性(P<0.01).HE染色、普鲁士蓝染色及电镜切片显示淋巴结内的USPIO铁颗粒主要分布于淋巴结髓索结构内,副皮质区及皮质区巨噬细胞相对较少,与MRI图像相对应;电镜检查显示USPIO颗粒均存在于巨噬细胞的胞饮泡内.肿瘤转移淋巴结中,4枚正常淋巴结结构丧失,19枚仍存在部分淋巴结结构但其内含USPIO铁颗粒的巨噬细胞减少且巨噬细胞内铁颗粒数目减少,3枚仅见小片状包膜下转移灶.结论 良恶性淋巴结USPIO强化特征与淋巴结的超微结构特别是巨噬细胞在结内的分布及其功能状态有较密切关系,可能影响USPIO对淋巴结性质的诊断准确性.     

整合素αvβ3在乳腺癌中的表达及与骨髓微转移的关系

目的：研究整合素αvβ3在乳腺癌中的表达及抗整合素αvβ3抗体LM 609在乳腺癌骨髓微转移中的作用.方法：免疫组织化学SABC法检测69例女性乳腺癌患者肿瘤组织整合素αvβ3表达及RT-PCR法检测乳腺癌骨髓微转移状况.流式细胞仪检测人乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s整合素αvβ3的表达.建立BALB/c裸鼠乳腺癌骨髓微转移模型.实时荧光定量RT-PCR检测抗整合素αvβ3抗体LM609对裸鼠乳腺癌骨髓微转移模型的影响.结果：乳腺癌标本免疫组化结果,整合素αvβ3阳性患者30例,占43.5%;阴性患者39例,占56.5%.乳腺癌骨髓微转移RT-PCR检测阳性患者22例,占31.9%,阴性患者占68.1%.卡方检验,χ^2=9.564,P＜0.05.两者有显著相关关系.MCF-7细胞膜上整合素αvβ3受体为阴性,MDA-MB-231、MDA-MB-435s细胞膜上整合素αvβ3受体阳性.在由整合素αvβ3受体阳性细胞制作的裸鼠乳腺癌骨髓微转移模型中,经LM609处理后,可显著减少乳腺癌骨髓微转移的肿瘤细胞（P＜0.05）.结论：整合素αvβ3在乳腺癌中高表达与骨髓微转移有显著相关关系,用抗整合素αvβ3抗体可抑制乳腺癌的骨髓微转移.     

慢性盆腔炎性不孕患者子宫内膜整合素α_vβ_3表达及与甾体激素关系的研究

[目的]研究慢性盆腔炎性不孕患者子宫内膜整合素αvβ3的表达,并分析其体内甾体激素与整合素αvβ3表达的相关性.[方法]选取25例慢性盆腔炎性不孕症患者,同时选择15例具有正常生育能力的育龄妇女,分别设为实验组和对照组,采用流式细胞荧光标记测量技术对子宫内膜中整合素αvβ3的表达进行定量检测.在同期内取血清检测实验组及对照组体内雌孕激素水平,分析甾体激素与子宫内膜整合素αvβ3表达在植入窗口期(种植期)的相关性.[结果](1)两组黄体中期血清雌二醇(E2)水平及雌二醇/孕酮(E2/P)比值比较均无显著性差异(P>0.05),而血清P水平比较有显著性差异(P<0.05).(2)两组黄体中期(分泌中期)子宫内膜整合素αvβ3表达比较差异有显著性意义(P<0.05).(3)雌激素与子宫内膜整合素αvβ3无相关性,而孕激素与整合素αvβ3显示正相关性,孕激素的表达水平越高,整合素αvβ3表达水平相应也越高.[结论]整合素αvβ3在正常育龄妇女子宫内膜种植窗期的表达高于慢性盆腔炎性不孕患者;整合素的表达水平与卵巢分泌的甾体激素孕激素的表达呈一致性,孕激素影响着整合素αvβ3表达的水平.     

大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的 应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性.方法 分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞.将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem 200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜.采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价.体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像.结果 该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低.结论 利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞.     

整合素αvβ3特异性结合肽的筛选及初步鉴定

目的 应用噬菌体随机肽库展示技术筛选能与整合素αvβ3分子具特异性结合功能的小肽分子,并对其功能进行初步鉴定.方法 根据整合素αvβ3分子细胞外配体结合区域的品体结构及蛋白质序列设计①～⑤号5条短肽,并作为筛选配基,分别经过3轮"吸附-洗脱-扩增"后,ELISA鉴定阳性克隆,DNA测序和分析,粘附试验进一步分析化学合成多肽的功能.结果 经3轮亲和筛选后,噬菌体克隆得到有效富集,以⑤号肽为代表,ELISA鉴定显示7个阳性克隆能与⑤号合成短肽有较强结合活性.进行DNA测序,多重序列分析获得2个多肽基序:****HRH,HWR****.粘附试验表明化学合成多肽FITC-HLPWHRH,FITC-HWRLHPH与表达整合素αvβ3的细胞株具有一定的亲和性,且结合能被αvβ3分子配体纤维连接蛋白所抑制.结论 通过噬菌体随机展示肽库技术在体外对合成的短肽进行筛选,可以获得与整合素αvβ3分子具特异性结合能力的小肽分子.     

磁共振示踪超小超顺磁性纳米铁颗粒标记大鼠C6脑胶质瘤细胞的效果分析

目的 监测不同浓度超小超顺磁性纳米铁颗粒（USPIO）对不同数量大鼠C6胶质瘤细胞离体及载体标记的效果。方法采用0、25、50μg／ml浓度的USPIO标记1×10^6,2×10^6和1×10^7大鼠C6胶质瘤细胞,离体MRI扫描T1WI,T2WI,GRE／30°序列成像,测定细胞群信号。0、25、50μg／ml^3种浓度USPIO标记1×10^6大鼠C6胶质瘤细胞后,立体定向分别接种于6只大鼠（每种浓度接种2只）的右侧额叶,载体MRI扫描T1,WI,T2WI,GRE／30°序列成像,测定其信号强度。结果不同数量的大鼠C6胶质瘤细胞与0、25、50μg／ml浓度的USPIO培养12h,离体MRI不同序列测定不同浓度USPIO标记相同数量的细胞群,GRE／30。和T2,WI测定的各组之间差异均有统计学意义,50与25μg／ml组与0μg／ml组比较,差异均有统计学意义（t=4．19与3．38,P〈0．05）;同一浓度USPIO标记大鼠C6胶质瘤细胞,信号强度与细胞数量有关（t=5．16,2．35,4．41;P〈0．05）。普鲁士蓝染色镜下观察,发现标记的细胞从25到50μg／ml染色程度逐渐加深。载体25μg/ml浓度的USPIO标记大鼠C6胶质瘤细胞在MRI成像中清楚显示病变的范围及信号强度。结论USPIO可以标记大鼠C6胶质瘤细胞。MRI的信号强度与同一浓度USPIO标记细胞的数量成反比,25μg／ml浓度USPIO标记的肿瘤细胞,活体接种脑内完全可以达到MRI示踪的目的。