乙型肝炎病毒免疫耐受动物模型的建立与验证

用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染1d龄幼鸭建立了乙型肝炎免疫耐受动物模型,随访22周,鸭乙型肝炎病毒表面及前表面抗原(DHBs/presAg)及DHBV DNA阳性不变。在持续性感染鸭血清中未能检出抗DHBs/pres或抗鸭乙型肝炎核心(DHBc)抗体。用纯化的DHBs/pres Ag及DHBcAg与鸭外周血淋巴细胞作特异性淋巴细胞增殖试验,结果也未见阳性反应。以DHBs/presAg及DHBcAg分别免疫上述免疫耐受鸭,每3周1次。连续免疫5次,也未能刺激产生相应的抗体及特异性淋巴细胞增殖反应,从而首次建立并确证了1d龄鸭感染DHBV导致的免疫耐受动物模型。     

鸭乙型肝炎病毒感染与肝组织学病变关系的研究

双盲研究表明,江苏麻鸭的血清DHBV DNA与肝组织匀浆DHBV DNA检出率无明显差异;鸭乙型肝炎病毒感染与肝组织点灶状坏死有关,并可导致肝组织超微结构的异常。     

DHBV DNA在鸭胰脾组织中原位杂交的研究

目的：对慢性DHBV感染鸭的肝、胰、脾组织DHBV DNA作对比研究。方法：采用原位杂交技术。结果：DHBV不仅可以感染鸭肝细胞,且可感染胰、脾组织,DHBV DNA阳性细胞的分布密度以肝组织最高,胰脾次之。结论：DHBV具有组织器官泛嗜性,但其在肝外组织中的复制似不及在肝细胞中活跃。     

乙型肝炎病毒在宿主内不受核苷类药物影响的机理探讨

目的 探讨乙型肝炎病毒在宿主中不受药物影响而得以长期与宿主共存的机理。方法 以核苷类药物拉米夫定（3TC）和无环鸟苷（ACV）对鸭乙肝病毒（DHBV）感染一日龄广州麻鸭模型进行治疗，以斑点杂交法检测治疗前后和停药后鸭血清中鸭乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（DHBV－DNA）的变化，并取提鸭的肝，肾，脾，肺，心组织中的DNA，用聚合酶链反应（PCR）方法检测DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况。结果 以斑点杂交法检测鸭血清DHBV－DNA，3TC和ACV两个治疗组在治疗后5－10d内血清DHBV－DNA含量持续下降（与模型组比较均P＜0．05），但停药后有回升倾向；用PCR方法检测各组的肝，肾，脾，肺，心组织，显示治疗后DHBV－DNA在各脏器组织中存在的情况与模型组比无显著性差异（P＞0．05）。进一步比较了斑点杂交法和PCR法检测的结果，显示斑点杂交法检测组织中病毒远不如PCR法敏感，并提示可能组织中病毒复制量很低，以致用斑点杂交法检测出现很多假阴性。结论 乙型肝炎病毒感染宿主后，药物治疗只对宿主血清DHBV－DNA含量有影响，但未发现对肝和肝外脏器组织中DHBV－DNA有影响，乙肝病毒不受药物影响而长期在宿主中存在并低水平持续复制，可导致宿主机体对其无法识别和清除而形成慢性感染。建议使用较敏感的PCR法监控组织中DHBV－DNA含量，作为评价药物长期疗效的指标之一。     

鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测

目的 探讨在不同程度肝损伤的DHBV感染麻鸭外周血中能否检测出DHBVcccDNA.方法 选择持续感染DHBV的2月龄上海麻鸭24只随机分均分为4组,分别以(1)A组:D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100 μg/kg;(2)B组:D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl4灌胃2次;(3)C组:D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl4灌胃2次;(4)NC组:生理盐水处理作为正常对照组(NC组).在处理后0、24、36和48 h进行血清ALT、DHBV载量和DHBV cccDNA检测,最后处死动物取肝组织评价肝损伤程度,并检测肝组织中的总DHBV DNA和DHBV cccDNA.结果 NC组鸭肝脏无明显病理改变,A组、B组和C组鸭则分别出现点状坏死至大片肝坏死的肝损伤,3组之间的肝损伤程度分级差异有统计学意义(P＜0.01).B组和C组在处理后48 h分别有1只和4只鸭死亡.NC组和A组各检测时点血清中均未检测到DHBV cccDNA;B组和C组在处理后36 h分别有2只和3只鸭血清中检测到DHBV cccDNA,含量在(0.32～1.72)×104拷贝/ml之间,在处理后48 h两组各有1只鸭血清中仍可以检测出DHBV cccDNA.Logistic逐步回归分析显示血清中DHBVcccDNA的检出率与肝损伤程度评分有关(P=0.0029),而与血清DHBV载量、ALT水平以及肝组织中的总HBV DNA和DHBV cccDNA 含量无关.结论 在肝组织发生严重损伤时,血清中可以出现DHBV cccDNA,血清中DHBV cccDNA的检出与肝组织损伤程度显著相关.     

鸭乙型肝炎动物模型的制备——DHBV经不同途径对雏鸭的实验感染

本实验对不同日龄雏麻鸭用含鸭乙型肝炎病毒(DHBV)鸭血清,经灌胃、静脉注射、肌肉注射等途径的人工感染,通过血清斑点杂交技术(~(32)P—DHBV DNA探针)、肝组织病理切片、电镜检查等方法,作动态观察,结果如下:①1～15d龄健康雏麻鸭94只,按日龄分组予DHBV灌胃后,经每周1次的反复采血检测,未发现血清DHBV DNA阳转者。②14d龄健康雏麻鸭30只,分组予静脉注射或肌内注射接种DHBV,1周后发现血清DHBV DNA阳转率分别为35.7％(5/15)和42.9％(6/15),2周后     

阿的福韦在鸭乙型肝炎模型及2.2.15细胞中抗乙型肝炎病毒的药效研究

目的:观察阿的福韦体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用及体外抗乙型肝炎病毒(HBV)效果.方法:采用鸭乙型肝炎动物模型,用阿的福韦口服治疗10天,检测用药前后血清中的DHBV DNA、DHBsAg,并取肝脏样本提取总DNA,作Southern Blot分析.此外,以2.2.15细胞为靶细胞,给药后通过检测细胞培养液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA观察阿的福韦抗HBV效果.结果:阿的福韦各剂量组用药后均能使血清中的DHBVDNA显著降低或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01),但停药后有DHBV DNA回升现象;用药前后DHBsAg无明显改变.肝组织Southern Blot分析亦显示用药后肝脏中DHBV DNA有明显降低,停药后DHBV DNA反跳明显.大剂量阿的福韦加入细胞培养12天,对HBsAg抑制率为17.01%,对HBeAg抑制率为26.80%,对HBV DNA抑制率为26.92%.结论:阿的福韦在鸭体内有抗鸭乙型肝炎病毒的作用,但停药后DHBVDNA有"反跳"现象;体外实验无明显抗HBV病毒作用.     

不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的实验研究

目的：探讨不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型的影响因素,观察应用该模型抗病毒的效果。方法：采集鸭血清,应用PCR方法定性检测鸭血清中病毒DNA;定量PCR方法检测鸭血清中病毒DNA载量变化;用抗病毒药物处理,观察其在鸭DHBV感染模型中的抗病毒效果。结果：不同种鸭DHBV自然感染率不同,樱桃谷鸭为8.75%,湖北麻鸭两个批次分别为17.80%和10.68%;静脉注射和腹腔注射两途径均能致雏鸭感染DHBV,静脉注射感染率80%,腹腔注射感染率65%;鸭感染DHBV后,体内病毒载量维持在106~108拷贝/mL,可持续20天以上;抗病毒药物处理后,在不同DHBV模型中其抗病毒效果变化趋势一致。结论：鸭的种类和人工感染途径可影响DHBV感染率;雏鸭感染DHBV后其体内有持续性的病毒血症;DHBV感染模型是药物抗病毒研究较好模型。     

不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的实验

目的探讨不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型的影响因素,观察应用该模型抗病毒的效果。方法采集鸭血清,应用PCR方法定性检测鸭血清中病毒DNA;定量PCR方法检测鸭血清中病毒DNA载量变化;用抗病毒药物处理,观察其在鸭DHBV感染模型中的抗病毒效果。结果不同种鸭DHBV自然感染率不同,樱桃谷鸭为8.75%,湖北麻鸭两个批次分别为17.80%和10.68%;静脉注射和腹腔注射两途径均能致雏鸭感染DHBV,静脉注射感染率80%,腹腔注射感染率65%;鸭感染DHBV后,体内病毒载量维持在106～108copies/mL,可持续20 d以上;抗病毒药物处理后,在不同DHBV模型中其抗病毒效果变化趋势一致。结论鸭的种类和人工感染途径可影响DHBV感染率;雏鸭感染DHBV后其体内有持续性的病毒血症;DHBV感染模型是药物抗病毒研究较好模型。     

后天感染河南樱桃谷鸭乙型肝炎病毒模型的建立

目的:建立并验证后天感染河南樱桃谷鸭乙型肝炎病毒(DHBV)模型。方法:筛选3日龄DHBV阴性河南樱桃谷鸭,经胫静脉注射DHBV阳性血清建立DHBV模型鸭,连续观察42 d,采用荧光定量PCR方法检测鸭血清和肝脏中DHBV DNA变化情况。DHBV阴性鸭48只,分为正常组、模型组和3TC组,每组16只。模型组和3TC组于鸭3日龄时建模,模型组给予生理盐水2 mL/(kg·d),3TC组给予3TC 20 mg/(kg·d),连续给药10 d。PCR检测给药5、10 d后及停药3 d后血清和肝脏中DHBV DNA含量,并进行肝脏病理学观察。结果:感染2 d后,鸭血清和肝脏中均可检测到DHBV DNA。血清DHBV DNA水平第14天达到高峰,拷贝数为7.7×109mL-1,肝脏DHBV DNA第21天达到高峰,拷贝数达2.1×109mL-1,42 d内均维持较高的DHBV DNA水平。与模型组比较,3TC组鸭血清和肝脏DHBV DNA拷贝数明显降低(血清:F组间=17.625,F时间=68.141,F交互=134.517,P<0.001;肝脏:F组间=69.430,F时间=35.330,F交互=75.770,P<0.001)。3TC组鸭用药10 d后,血清和肝脏HBV DNA抑制率分别为86.5%和84.9%,但停药3 d后有轻度"反弹"现象。3TC组肝组织病变较模型组有明显改善。结论:河南樱桃谷鸭后天感染DHBV较敏感,病毒在体内增殖稳定,是DHBV感染的理想动物模型。