脂肪细胞谷氨酰胺合成酶抑制结肠癌细胞的腹腔转移及血管生成

目的 探讨脂肪细胞谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)对结肠癌腹腔转移及血管生成的影响.方法 转基因小鼠的鉴定:Western blot检测野生型(WT)小鼠及脂肪细胞GS转基因(TgGs)小鼠脂肪细胞GS蛋白的表达.体内实验:分别构建WT小鼠及TgGs小鼠的腹腔转移模型,观察结肠癌细胞在腹腔的种植情况;免疫组化检测移植瘤的血管生成情况.体外实验:取WT及TgGS小鼠的脂肪进行无菌培养,收集条件培养基;通过小管形成实验、CCK8实验、Transwell实验观察条件培养基对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的小管形成、增殖及迁移的影响.结果 Western blot检测结果显示,TgGs小鼠较WT小鼠脂肪细胞GS蛋白水平显著上调(P＜0.05).TgGs小鼠较WT小鼠腹腔移植瘤数量明显减少[(6.33±4.04)vs(16.00±6.56),P＜0.05],体积明显减小[(2.35±1.93)vs(9.37±5.07),P＜0.01].免疫组化结果显示,TgGs小鼠肿瘤血管生成明显少于WT小鼠(P＜0.05).体外小管形成实验显示TgGs组较WT组HUVECs小管形成总长度明显缩短(P ＜0.05);CCK8实验显示TgGs组及WT组HUVECs的增殖差异无统计学意义(P＞0.05);Transwel实验显示TgGs组HUVECs细胞迁移数量明显少于WT组[(15.33±5.50)vs (78.33 ±13.58),P＜0.01].结论 脂肪细胞GS可抑制结肠癌腹腔转移及肿瘤血管生成.     

巨噬细胞在结肠癌CT-26细胞获得性5-FU耐药中的作用

目的 探讨巨噬细胞在结肠癌CT26细胞对5-FU产生获得性耐药过程中的作用及其机制.方法 分别用正常培养基(NM)、巨噬细胞培养上清(CM)及预先用低剂量5-FU处理过的巨噬细胞培养上清[CM(5-FU)]处理CT-26细胞,并给予10μmol/L 5-FU处理,用CCK-8检测各组细胞增殖情况,PI/Annexin-V流式细胞术检测各组细胞凋亡情况及Western blot检测各组细胞凋亡信号通路.建立CT26小鼠皮下移植瘤模型,应用上述条件培养基处理联合5-FU化疗,动态观察移植瘤生长情况.结果 检测细胞凋亡情况发现,5-FU处理组CT26细胞的凋亡细胞百分比显著高于对照组(P＜0.05);Western blot检测结果显示5-FU处理组凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及P-JNK的表达较对照组显著上调(P＜0.05);Western blot检测结果及结肠癌CT26细胞小鼠移植瘤模型发现P-JNK抑制剂可显著抑制由5-FU诱导的CT26细胞Caspase-3凋亡信号通路的激活;CCK-8检测结果及小鼠移植瘤模型中均发现CM(5-FU)能够显著降低CT26细胞对5-FU的化疗敏感性;细胞凋亡检测及Western blot检测结果发现CM(5-FU)可抑制由5-FU诱导的P-JNK/Caspase-3凋亡信号通路的激活.结论 5-FU可激活结肠癌CT-26细胞的P-JNK依赖的Caspase-3凋亡信号通路以发挥抗癌作用;5-FU诱导的巨噬细胞可导致结肠癌CT26细胞产生5-FU获得性耐药,其机制可能是5-FU诱导的巨噬细胞上清可拮抗CT-26细胞中5-FU激活的P-JNK/Caspase-3凋亡信号.     

LncRNA-ROR抑制结直肠癌细胞转移的作用研究

目的了解LncRNA-ROR在结直肠癌细胞转移中的作用。方法在前期工作中,已经发现LncRNA-ROR在结直肠癌组织中低表达,并抑制肠癌细胞的增殖。进一步,我们采用Transwell功能研究LncRNA-ROR的过表达对结直肠癌细胞SW620迁移的影响;并采用划痕实验探索LncRNA-ROR过表达后结直肠癌细胞SW620伤痕愈合的变化。结果SW620细胞在ROR过表达后,穿过人工膜的细胞数减少(P＜0.01);在迁移和侵袭实验中,与对照组比较,SW620 LncRNA-ROR穿过Transwell膜的细胞数减少(P＜0.01),侵袭能力减弱(P＜0.01);划痕实验中,划痕48 h后LncRNA-ROR的细胞间间距大于对照组(P＜0.01)。结论LncRNA-ROR抑制结直肠癌细胞的转移。     

LIM同源盒基因8对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为的影响

目的 探讨LIM同源盒基因8(Lhx8)对卵巢癌细胞株SKOV3增殖、转移和侵袭的影响.方法 采用Lhx8过表达慢病毒(LV-Lhx8)转染卵巢癌细胞株SKOV3构建过表达模型;设阴性对照慢病毒(LV-NC)组通过Lipofectamine 2000转染Lhx8-siRNA构建细胞干扰模型并设阴性对照序列(FAM-siRNA;NC)组;野生(WT)组细胞仅给予等量不含病毒或任何干扰片段的转染试剂.通过免疫荧光、蛋白质印迹法和qPCR验证过表达和干扰效果.采用EDU和细胞周期实验检测过表达或干扰Lhx8后细胞的增殖能力;采用Transwell和划痕实验分别检测转染后细胞的迁移和侵袭能力.结果 Lhx8过表达组SKOV3细胞中Lhx8的表达高于LV-NC和WT组(P＜0.01),干扰后Lhx8的mRNA和蛋白表达均降低,与NC和WT组相比差异有统计学意义(P＜0.01).与WT和LV-NC组相比,Lhx8过表达抑制SKOV3细胞的增殖(P＜0.01),而干扰Lhx8后其增殖能力增加(P＜0.01);细胞周期实验结果示过表达Lhx8能够增加进入G0/Q期的细胞数目,从而抑制细胞增殖(P＜0.01),干扰Lhx8表达后进入S期的细胞数目多于WT和NC组(P＜0.01).划痕和Transwell实验结果示SKOV3细胞过表达Lhx8后其迁移和侵袭能力均低于WT和LV-NC组(P＜0.01),干扰Lhx8表达后细胞的迁移和侵袭能力均高于WT和NC组(P＜0.01).SKOV3细胞过表达Lhx8后基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达均低于WT和LV-NC组(P＜0.01),干扰Lhx8后MMP-2、MMP-9表达均高于WT和NC组(P＜0.01).结论 Lhx8能够抑制SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭,同时能够下调MMP-2和MMP-9的表达.     

吡非尼酮抑制肿瘤相关成纤维细胞促进结肠癌细胞系HT29上皮间质转化的作用及机制

目的:探讨吡非尼酮在肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）诱导的HT29结肠癌细胞系侵袭、迁移、增殖、上皮-间质转化（EMT）中的作用及机制。方法:利用共培养小室将CAFs与HT29共培养后CCK-8测定HT29增殖效率;Real time-PCR和Western blot检测HT29结肠癌细胞系E-cadherin和Vimentin转录及蛋白表达水平;Transwell实验检测HT29结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。ELISA技术检测CAFs细胞上清液中细胞因子的表达。结果:吡非尼酮抑制CAFs对HT29增殖促进作用（P＜0.05）;CAFs条件培养基培养HT29后,Vimentin表达水平显著升高（P＜0.05） ,E-cadherin显著降低（P＜0.05）;吡非尼酮处理CAFs的条件培养基对HT29细胞中两种蛋白无明显影响;Transwell实验表明CAFs与HT29共培养后,其侵袭和迁移能力明显增强（P＜0.05）;ELISA结果提示CAFs分泌TGF-β1功能受吡非尼酮抑制且存在剂量关系。结论:吡非尼酮通过抑制CAFs分泌TGF-β1抑制CAFs诱导HT29结肠癌细胞系侵袭、迁移、增殖、上皮-间质转化。     

水通道蛋白1对内皮祖细胞迁移功能的影响

目的观察水通道蛋白1(AQP1)对内皮祖细胞(EPC)增殖迁移功能的影响。方法体外分离AQP1野生型(WT)(n=6)和敲除型(KO)小鼠(n=6)骨髓细胞并定向培养分化为EPC。应用免疫荧光法检测细胞表面抗原鉴定EPC,通过无标记活细胞动态分析技术、细胞Transwell迁移实验及划痕实验比较AQP1 WT和KO小鼠中EPC的功能差异。结果对小鼠EPC培养观察发现,细胞最初保持悬浮状态,7 d内逐渐黏附贴壁成典型的间充质干细胞,间充质干细胞经内皮细胞专用培养基培养7 d后逐渐分化贴壁,14 d后细胞继续增殖,形态为梭形或多边形,并融合成铺路石样的EPC细胞。细胞表面标志鉴定发现,应用内皮细胞专用培养基培养7 d后细胞CD133及CD31表达阳性,随着培养时间的延长在14 d时CD34及Flk-1表达阳性。免疫荧光法验证结果显示,AQP1仅在AQP1 WT小鼠的EPC中表达阳性。对不同AQP1状态下EPC的功能研究结果显示,培养72 h的AQP1 WT小鼠与KO小鼠EPC细胞增殖数目无显著差异。Transwell检测结果显示,AQP1 KO小鼠其EPC迁移能力较WT小鼠明显减弱。细胞划痕实验检测结果显示,AQP1 KO小鼠EPC的划痕愈合能力也明显低于WT小鼠。结论 EPC最初表现出干细胞特征,随着培养时间延长,逐渐表现出内皮细胞特征。AQP1可影响EPC的迁移能力而非增殖能力。     

华蟾素通过调控M2型巨噬细胞极化抑制结直肠癌转移

目的 探讨华蟾素通过调控M2型巨噬细胞极化抑制结直肠癌转移的作用。方法 将THP-1诱导成M0型巨噬细胞,收集HCT116细胞的条件培养基,刺激M0型巨噬细胞,通过流式细胞术、RT-qPCR、ELISA实验观察M2型巨噬细胞极化状态;收集M0型巨噬细胞和HCT116-Mφ细胞的条件培养基,刺激HCT116细胞,通过划痕实验和Transwell实验观察迁移和侵袭能力;用CCK-8实验检测华蟾素对HCT116细胞活力的影响;收集HCT116和HCT116+华蟾素的条件培养基,刺激M0型巨噬细胞,通过流式细胞术、RT-qPCR、ELISA实验观察M2型巨噬细胞极化状态;收集HCT116-Mφ细胞和(HCT116+华蟾素)-Mφ细胞的条件培养基,刺激HCT116细胞,通过划痕实验和Transwell实验观察迁移和侵袭能力的改变。结果 M0型巨噬细胞在HCT116细胞的条件培养基刺激后,形态变成梭形的细胞,CD11b⁺CD206⁺细胞比例增高,M2型巨噬细胞标志物白细胞介素-10(IL-10)及转化生长因子-β(TGF-β)表达升高;HCT116细胞在...     

华蟾素抑制结肠癌细胞增殖转移的实验研究

目的:观察华蟾素对结肠癌细胞HCT116细胞增殖、迁移的影响,探讨其可能的作用机制。方法:常规体外培养结肠癌细胞HCT116细胞系,采用CCK-8法检测不同浓度华蟾素作用不同时间对HCT116细胞增殖的抑制作用,细胞划痕实验和Transwell小室法检测华蟾素对细胞迁移能力的影响,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、钙黏蛋白(E-Cadherin)的表达水平。结果:CCK-8法检测结果表明,华蟾素对HCT116细胞的生长有明显抑制作用,其抑制作用随药物浓度和作用时间的增加而增强(P0.05);细胞划痕实验和Transwell小室法结果显示,随华蟾素药物浓度的增加,HCT116细胞迁移能力下降(P0.05);Western blot结果表明,华蟾素能够明显抑制HCT116细胞MMP-9的蛋白表达并上调E-Cadherin的蛋白表达(P0.01),但对MMP-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。结论:华蟾素能够抑制人结肠癌细胞的增殖和转移,其机制可能与其抑制MMP-9和上调E-Cadherin的蛋白表达有关。     

苯噻啶对人肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响

目的 观察不同浓度苯噻啶(Pizotifen)对人肺腺癌A549和PC9细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响,并初步探究其机制。方法 取对数生长期的A549和PC9细胞,分为对照组(细胞对照组为培养基直接作用于细胞,溶剂对照组为含有0.1%DMSO的培养基作用于细胞)和实验组(浓度分别为10、20、30、40μmol/L的苯噻啶作用于细胞)。CCK-8法检测人肺腺癌细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell迁移实验检测其迁移能力,Transwell侵袭实验检测其侵袭能力,ELISA法检测Wnt3a/β-catenin信号通路蛋白、上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cad)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平。结果 与溶剂对照组相比：CCK-8结果显示,实验组A549和PC9细胞活力降低,出现不同程度的增殖抑制现象,在20、30、40μmol/L浓度组有一定的时间依赖性(P<0.05);划痕实验结果表明,实验组划痕愈合率小于对照组,苯噻啶浓度越高,划痕愈合率越低(P<0.05);Transwell迁移和侵袭实验结果显示,实验组穿过小室的肺腺癌细胞数量明显低...     

miR-128抑制结肠癌侵袭转移的机制研究

目的分析miR-128在结肠癌细胞中的表达情况,研究其对结肠癌细胞生物学行为的影响及作用机制。方法对转染miR-128模拟物后的结肠癌SW48细胞进行培养,采用MTT法行细胞增殖实验检测细胞增殖能力,细胞划痕法检测细胞迁移能力,Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力;并采用RT-RCR检测miR-128mRNA的表达,Westernblot法检测miR-128蛋白的表达。结果转染miR-128模拟物后的结肠癌SW48细胞较转染空白对照模拟物后的,细胞增殖、侵袭及迁移能力均下降（均P＜0.05）,且转录因子Sp1基因在mRNA及蛋白水平均下降（均P＜0.05）。结论miR-128可抑制结肠癌细胞增殖及侵袭转移,可能通过调控Sp1基因发挥上述作用。     

CFL1的表达对前列腺癌进展影响的研究

目的:探讨CFL1在前列腺癌中的表达情况,并明确其对前列腺癌进展的影响。方法:采用免疫组化、qPCR及Western blot检测CFL1的表达情况,采用Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭能力,CCK-8实验检测细胞的增殖能力。结果:在恶性程度高的前列腺癌中,CFL1的蛋白及mRNA表达水平最高,恶性程度低的次之,良性前列腺增生最低（P＜0.05）;Transwell实验表明si-CFL1组较si-NC组,其迁移和侵袭能力均降低（均P＜0.05）;CCK-8实验显示敲低CFL1后,前列腺癌细胞的增殖能力降低（P＜0.05）。结论:CFL1在前列腺癌中高表达,而减低其表达水平可以抑制前列腺癌的进展。     

过表达趋化因子受体4的内皮祖细胞影响血管平滑肌细胞迁移、增殖

目的 研究过表达趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)迁移、增殖的影响.方法 分离培养并鉴定大鼠骨髓来源EPCs.CXCR4的重组腺病毒感染EPCs后,流式细胞术、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测细胞膜CXCR4受体及mRNA表达,CCK-8法、Transwell法分别检测EPCs增殖活性、迁移能力.建立过表达CXCR4的EPCs与VSMCs非接触共培养模型,Transwell法、CCK-8法检测EPCs对VSMCs的迁移、细胞存活的影响.结果 CXCR4重组腺病毒感染EPCs 48 h后,EPCs细胞膜CXCR4受体和mRNA表达明显增高(P＜0.01),过表达CXCR4对EPCs增殖活性无明显影响,但可增强EPCs定向迁移能力(P＜0.01).共培养模型中,SDF-1α诱导下,CXCR4组VSMCs迁移、细胞存活率明显降低(P＜0.05),无SDF-1α诱导下空白对照组、GFP组及CXCR4组VSMCs的迁移、细胞存活率整体高于SDF-1α诱导下各组(P＜0.05).结论 过表达CXCR4可增强EPCs的迁移能力,在SDF-1/CXCR4调控轴中加强EPCs对VSMCs迁移和增殖的抑制作用,可用于防治血管再狭窄的细胞治疗.     

M2型巨噬细胞外泌体对皮肤创面愈合影响的探究

目的:探究M2型巨噬细胞来源的外泌体（M2exos）对成纤维细胞增殖、迁移的影响。方法:极化RAW264.7细胞并收集M2型巨噬细胞上清,提取并鉴定M2exos。通过免疫荧光观察L929真皮成纤维细胞对M2exos的摄取情况,设对照组和M2exos组,通过CCK-8、细胞划痕实验分别观察在0、24、48、72 h对成纤维细胞的增殖和迁移作用。建立皮肤创口模型,随机将12只C57BL/6J小鼠分为PBS组和M2exos组。两组分别注射200 μL PBS、M2exos（500 μg/mL）,在第1、4、7天观察、拍摄记录,并取材进行HE染色。结果:成功极化得到M2型巨噬细胞,提取和鉴定了M2exos。与对照组相比,M2exos组在48、72 h对成纤维细胞具有促进增殖（t=26.73,P＜0.000 1;t=6.648,P＜0.01）、迁移（t=5.196,P＜0.05;t=22.00,P＜0.000 1）作用。对C57BL/6J小鼠的研究显示,与PBS组相比,在第4、7天时M2exos组创面显著缩小（t=32.80、 51.16,均P＜0.000 1）。结论:M2exos通过促进成纤维细胞增殖和迁移,对小鼠创面愈合有显著的促进作用。     

载奥沙利铂类弹性蛋白多肽水凝胶的制备及其对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用

目的 制备担载奥沙利铂（OXA）的类弹性蛋白多肽（ELPs）水凝胶,研究其体外药物释放情况及对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用。 方法 利用大肠杆菌（E.coli）系统表达ELPs原核蛋白,利用可逆相变循环法（ITC）进行蛋白纯化,将ELPs蛋白溶液与交联剂四羟甲基氯化磷（THPC）混匀制备水凝胶,扫描电子显微镜（SEM）观察水凝胶的超微结构,CCK-8法检测不同浓度ELPs水凝胶处理后CT26细胞和小鼠成纤维NIH3T3细胞存活率,活/死细胞染色法观察30和40 g?L^－1 ELPs水凝胶作用48 h后CT26细胞存活情况。制备载OXA的ELPs水凝胶,检测其在不同pH值（6.5和7.4）缓冲液中的药物释放情况,CCK-8法检测加入载不同浓度（0.25、1.00、4.00、16.00和64.00 mg?L^－1）OXA的ELPs水凝胶浸泡液后各组CT26细胞存活率和处理不同时间各组CT26细胞存活率。 结果 凝胶电泳分析,E.coli诱导后在预计相对分子质量38 000附近出现明显加粗的蛋白条带,ITC纯化后泳道中无明显杂蛋白存在。ELPs蛋白溶液中加入THPC后由透明液体状态转变为不透明的白色水凝胶,SEM观察显示出排列整齐的孔隙和三维结构;CCK-8法检测,经不同浓度ELPs蛋白处理后CT26细胞和NIH3T3细胞存活率仍接近100%;活/死细胞染色,ELPs水凝胶处理后的CT26细胞在荧光显微镜下呈现明亮的绿色荧光。载OXA的ELPs水凝胶能在体外持续释放OXA,在pH值6.5条件下OXA的释放速度较pH值7.4条件下稍快;CCK-8法检测,载不同浓度OXA的ELPs水凝胶浸泡液呈剂量依赖性抑制CT26细胞增殖,且随孵育时间的延长CT26细胞存活率逐渐降低。 结论 载OXA的ELPs水凝胶具有持续释放OXA的特性,能够高效且持续地杀伤小鼠结肠癌CT26细胞,可作为一种安全有效的药物递送载体用于抗肿瘤研究。     

TP53 G199X和V157fs点突变对卵巢癌A2780细胞功能的影响

目的：通过细胞实验对致病候选基因TP53进行功能实验,探讨TP53G199X和V157fs点突变对卵巢癌A2780细胞蛋白表达、增殖、迁移和侵袭的影响。方法：选择无内源性TP53基因表达的卵巢癌A2780细胞,分为野生型组、G199X组、V157fs组和空载体组。构建TP53野生型质粒,利用点突变试剂盒构建筛选得到的G199X和V157fs 2个点突变的质粒,利用脂质体转染法在A2780卵巢癌细胞中转染野生型、突变型和空载体相关质粒。采用Western blotting法检测各组A2780细胞中P53蛋白表达,CCK-8实验法检测各组A2780细胞增殖活性,划痕实验检测各组A2780细胞划痕愈合率,Transwell细胞侵袭实验检测各组A2780细胞的侵袭细胞数。结果：A2780细胞经转染后,TP53 G199X和V157fs突变型组及空载体组细胞中无P53蛋白表达。与野生型组比较,G199X组、V157fs组空载体组细胞增殖活性明显升高（P<0.01）;G199X组和V157fs组A2780细胞划痕愈合率升高（P<0.05或P<0.01）;G199X组、V157fs组和空载体组侵袭细胞数明显升高（P<0.01）。结论：TP53G199X和V157fs 2个点突变在A2780细胞中可终止P53蛋白的表达并促进卵巢癌A2780细胞的增殖、迁移和侵袭。     

长链非编码RNA LINC01116靶向调控has-miR-4693-3P参与胶质瘤进程

目的 观察脑胶质瘤细胞中长链非编码RNA LINC01116表达变化及shRNA转染对其细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,同时探究LINC01116可能参与的调节方式。方法 取神经胶质瘤细胞系U251、U87MG、A172细胞及正常星形胶质细胞(NHA),采用Real TimePCR法检测LINC01116表达。随后胶质瘤细胞分别加入或不加入sh-RNA转染,CCK-8实验检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。生物信息学预测LINC01116可能的调节方式,并采用双荧光素酶报告基因验证RNALINC01116与has-miR-4693-3P的调控作用。结果 LINC01116在胶质瘤细胞中高表达,其抑制细胞增殖、抑制细胞迁移和胶质瘤侵袭。CCK8实验显示,sh-LINC01116处理的胶质瘤细胞存活率显著低于未转染的(P＜0.05)。细胞划痕实验显示,sh-LINC01116处理的U251细胞迁移能力明显低于对照组(P＜0.01)。Transwell实验显示,sh-LINC01116处理的U251细胞穿膜细胞数明显低于对照组(P＜0.01)。双荧光素酶报告基因结果显示LINC01116k可靶向调控has-miR-4693-3P。结论 胶质瘤多种细胞中LINC01116表达升高,shRNA转染能明显抑制其增殖、侵袭、迁移能力,同时LINC01116可靶向调控has-miR-4693-3P参与胶质瘤的进程。