层层自组装壳聚糖/肝素复合涂层膜对支架血栓形成的影响

目的:观察层层自组装壳聚糖/肝素复合涂层膜对支架血栓形成的影响.方法:通过逐层自组装的方式将壳聚糖和肝素逐层结合在316L不锈钢槽内,制成不同层数的涂层膜,以凝固法测定健康人血液在聚合物膜和不锈钢上作用2 h后的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT),并检测其抗凝血功能的稳定性.制备壳聚糖/肝素复合涂层膜支架,研究复合涂层膜支架在猪动静脉分流血栓模型中对支架血栓形成的影响.结果:备组复合涂层膜APTT和TT均较316L不锈钢组极显著延长(P<0.01),并且APTT和TT延长和复合涂层膜层数增加相关.复合涂层膜在2周内上述凝血功能无显著差异(P>0.05).在猪动静脉分流血栓模型中,复合膜涂布的金属支架形成的血栓重量极显著低于316L裸支架(P<0.001).结论:层层自组装壳聚糖/肝素复合涂层膜具有极显著的抗支架血栓作用,而且具有良好的稳定性.     

pSilence APE1对骨肉瘤诱导血管内皮细胞迁徙抑制作用的实验研究

目的观察APE1 siRNA表达载体pSilence APE1对骨肉瘤诱导血管内皮细胞迁徙的抑制作用及其与ES的协同作用.方法pSilence APE1转染骨肉瘤细胞9901和HOS;骨肉瘤和内皮细胞Transwell双室培养,计数迁移到内室膜背面的内皮细胞数,观察pSilence APE1及其联合ES对骨肉瘤细胞诱导内皮细胞迁徙的影响.结果ES低剂量组(350ng/ml)和高剂量组(700 ng/ml)与正常对照组有明显差异(P＜0.01).2μg pSilence APE1和3μg pSilence APE1较单独脂质体组有显著性差异(P＜0.01).2 μg pSilence APE1和ES低剂量(350 ng/m1)联合组抑制内皮细胞迁徙的作用显著高于单独对照组(P＜0.01).结论pSilence APE1可显著抑制骨肉瘤细胞诱导的血管内皮细胞迁徙,并且可能与ES具有协同抗血管生成的作用.     

转化生长因子-β1对人成熟树突状细胞生物物理特性和迁移能力的影响

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)对人成熟树突状细胞(mDCs)生物物理特性与迁移能力的影响.方法:用不同浓度TGF-β1(1μg/L、3μg/L、5μg/L、7μg/L)处理mDCs 24 h,按TGF-β1浓度将mDCs分为4组和对照组(未加入细胞因子);采用细胞渗透脆性实验检测mDCs的渗透脆性(未破碎细胞百分率),通过细胞电泳实验测定mDCs电泳率,荧光偏振实验和微吸管系统分别测定mDCs荧光片振度和被吸入管内的长度,以反映mDCs细胞膜的流动性和变形性,利用Transwell系统检测mDCs跨内皮细胞迁移百分率.结果:与对照组相比,(1)细胞渗透脆性,在1μg/L组mDCs破碎百分率增加,5μg/L组mDCs破碎百分率降低,差异有统计学意义(P＜0.05);(2)细胞电泳率,1 μg/L和3μg/L组mDCs电泳率下降,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);(3)细胞膜流动性和细胞变形性,细胞膜流动性在5 μg/L组增加;变形能力在5μg/L和7μg/L组增加,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);(4)细胞迁移能力,1μg/L和3μg/L组mDCs跨内皮细胞迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论:TGF-β1通过影响mDCs的生物物理特性从而抑制其跨内皮细胞迁移的能力.     

神经细胞牵张损伤后CsA对CaN活性和APP表达的影响

目的 研究神经细胞牵张损伤后环孢霉素A (cyclosporin A, CsA)对钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)活性和淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)表达的影响.方法 在Bioflex培养皿原代培养大鼠大脑皮层神经元.细胞分为正常对照组、损伤组和CsA组.多功能小型生物撞击机25 kPa的压力牵张细胞.损伤后损伤组不予以处理,而CsA组则给以10 nM CsA. 各组伤后1、6、24h,3d标本的CaN活性和APP蛋白表达,分别采用酶底物显色和Western blot方法进行检测.结果 牵张损伤后1h神经元的CaN活性已较正常对照组显著增加(P＜0.05),伤后6h更为明显(P＜0.01),并持续到伤后3d(P＜0.01);而伤后10nM CsA干预能在各时相点非常显著地降低CaN的活性(P＜0.01).APP伤后1h有增加趋势,但在伤后6h差异才具有统计学意义(P＜0.05),伤后24h、3d这种增加则更加明显(P＜0.01).伤后10nM CsA干预能在6、24h,3d显著地降低APP的表达增加(P＜0.05),其APP的表达仍显著高于正常对照组(P＜0.05).结论 CsA能降低神经细胞牵张损伤后CaN活性的增加并减少APP表达的增加,可能起到神经保护作用.     

铁转运蛋白影响非小细胞肺癌增殖迁移的研究

目的 观察铁转运蛋白(FPN)在非小细胞肺癌(NSCLC)中差异表达及探讨FPN作用NSCLC细胞迁移与增殖的机制.方法 免疫组化(IHC)检测肺癌标本(60例)及正常肺组织标本(20例)FPN表达水平.蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞系中FPN表达水平.分别构建FPN过表达体系(PCDH-FPN-F)和敲低体系(shFPN),通过West-emn blot和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证.划痕实验检测FPN对肺癌细胞迁移的影响.生长曲线法检测FPN对肺癌细胞增殖能力的影响.结果 相比于正常肺组织,肺癌组织标本中FPN表达显著降低(P = 0.000);相比于正常肺细胞系,肺癌细胞系中FPN表达量显著降低(P＜0.000 1).与对照组比较,过表达组FPN表达量显著升高(Western blot:P＜0.01,qRT-PCR:P＜0.000 1);与对照组比较,敲低组 FPN 表达量显著降低(Western blot:P＜0.001,qRT-PCR:P＜0.001).过表达FPN后,细胞划痕间伤口愈合距离在18 h和36 h明显低于对照组;细胞数目在第2天和第4天明显低于对照组.而敲低FPN后,细胞划痕间伤口愈合距离在18 h和36 h明显高于对照组;细胞数目在第2天和第4天明显高于对照组.结论 低表达FPN后,肺癌细胞迁移及增殖能力增强,这可能是肺癌中FPN差异表达的原因.     

缺氧应激对人肝癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响

目的 探讨缺氧应激对人肝癌细胞HepG2黏附、侵袭和迁移能力的影响.方法 缺氧(5%O2、5%CO2、90%N2)和常氧培养HepG2细胞.细胞.基质黏附实验测定常氧组和缺氧4、12、24h组HepG2细胞黏附能力;细胞侵袭和迁移实验测定缺氧和常氧24 h组HepG2细胞侵袭和迁移能力;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定常氧组和缺氧4、12、24 h组HepG2细胞缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α mRNA的表达量.结果 随着缺氧时间的延长HepG2细胞的黏附能力明显增强(P＜0.01),缺氧24 h组HepG2细胞侵袭和迁移能力明显高于常氧组(P＜0.01).常氧下HepG2细胞不表达HIF-1α mRNA,缺氧4 h时HIF-1α mRNA表达量最高,随后下降(P＜0.01),但仍高于常氧组.结论 缺氧应激上调HepG2细胞HIF-1α mRNA的表达,促进HepG2细胞黏附、侵袭和迁移.     

LIM同源盒基因8对卵巢癌细胞SKOV3生物学行为的影响

目的 探讨LIM同源盒基因8(Lhx8)对卵巢癌细胞株SKOV3增殖、转移和侵袭的影响.方法 采用Lhx8过表达慢病毒(LV-Lhx8)转染卵巢癌细胞株SKOV3构建过表达模型;设阴性对照慢病毒(LV-NC)组通过Lipofectamine 2000转染Lhx8-siRNA构建细胞干扰模型并设阴性对照序列(FAM-siRNA;NC)组;野生(WT)组细胞仅给予等量不含病毒或任何干扰片段的转染试剂.通过免疫荧光、蛋白质印迹法和qPCR验证过表达和干扰效果.采用EDU和细胞周期实验检测过表达或干扰Lhx8后细胞的增殖能力;采用Transwell和划痕实验分别检测转染后细胞的迁移和侵袭能力.结果 Lhx8过表达组SKOV3细胞中Lhx8的表达高于LV-NC和WT组(P＜0.01),干扰后Lhx8的mRNA和蛋白表达均降低,与NC和WT组相比差异有统计学意义(P＜0.01).与WT和LV-NC组相比,Lhx8过表达抑制SKOV3细胞的增殖(P＜0.01),而干扰Lhx8后其增殖能力增加(P＜0.01);细胞周期实验结果示过表达Lhx8能够增加进入G0/Q期的细胞数目,从而抑制细胞增殖(P＜0.01),干扰Lhx8表达后进入S期的细胞数目多于WT和NC组(P＜0.01).划痕和Transwell实验结果示SKOV3细胞过表达Lhx8后其迁移和侵袭能力均低于WT和LV-NC组(P＜0.01),干扰Lhx8表达后细胞的迁移和侵袭能力均高于WT和NC组(P＜0.01).SKOV3细胞过表达Lhx8后基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达均低于WT和LV-NC组(P＜0.01),干扰Lhx8后MMP-2、MMP-9表达均高于WT和NC组(P＜0.01).结论 Lhx8能够抑制SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭,同时能够下调MMP-2和MMP-9的表达.     

未折叠蛋白反应在严重烧伤大鼠淋巴液诱导肺内皮细胞凋亡中的作用

目的 探讨未折叠蛋白反应介导的凋亡通路在严重烧伤大鼠淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的作用.方法 选成年Wistar雄性大鼠20只,分为烫伤组(行30％体表面积Ⅲ度烫伤)和假伤组,建立大鼠胸导管淋巴瘘模型,收集伤后24h淋巴液,用于体外实验.将细胞实验分为烫伤淋巴液刺激组(A组)、烫伤淋巴液+4苯基丁酸(4-PBA)处理组(B组)和假伤淋巴液处理组(C组).刺激6h后,Annexin V/PI标记法流式细胞术检测细胞凋亡.western blot检测caspase12、葡萄糖调节蛋白78(GRt78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)等蛋白表达的情况.结果 A组细胞凋亡水平显著高于C组(P＜0.01),B组细胞凋亡水平显著低于A组(P＜0.01).A组GRP78、CHOP和caspase12蛋白表达水平显著高于C组,经PBA处理后3种蛋白水平显著降低(P＜0.01).结论 烧伤大鼠淋巴液可以引起血管内皮细胞凋亡,未折叠蛋白反应可能是其主要通路之一.     

体外共培养体系中胆管癌细胞对人脐静脉内皮细胞b-FGF和VEGF表达的影响

目的 探讨体外共培养体系中胆管癌细胞(QBC939)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 建立胆管癌QBC939细胞与HUVEC体外共培养体系,采用CCK-8法检测共培养不同时相HUVEC的增殖;ELISA检测共培养上清液中b-FGF含量;qRT-PCR和Western blot检测共培养不同时相点HUVEC细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达.结果 共培养后12、24、48 h和72 h,HUVEC增殖较对照组显著增高(P＜0.01).与0h组比较,共培养12、24、48 h上清液中b-FGF含量显著增高(P＜0.05).共培养12 h时VEGF mRNA表达显著增加,并持续至72 h(P＜0.01),VEGF蛋白表达在共培养12h后显著增高,24、48、72 h时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人胆管癌QBC939细胞可促进血管内皮细胞增殖、增加b-FGF分泌和VEGF表达.b-FGF和VEGF表达增加与肿瘤血管新生,以及肿瘤的生长和转移可能具有相关性.     

MicroRNA-205抑制黑素瘤细胞迁移和侵袭的作用及其机制

目的 探讨microRNA-205 (miR-205)表达对人类黑素瘤细胞株(A375和A2058)迁移和侵袭的作用及其分子机制.方法 转染miR-205过表达慢病毒(Lenti-miR-205)构建miR-205过表达的黑素瘤细胞A375和A2058细胞系(miR-205组),转染空白对照慢病毒作为对照细胞系(NC组).通过划痕实验和Transwell实验分别检测两组细胞迁移和侵袭能力,激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态和表达钙黏蛋白E(E-cadherin)的细胞数量与荧光强度,蛋白质印迹法检测E-cadherin、Twist、整合素(intergrin)、波形蛋白(vimentin)、Zeb1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达.结果 培养8h和24 h时miR-205组A375与A2058细胞的迁移能力均大于NC组(P＜0.01);miR-205组两种细胞的侵袭能力均低于NC组(P＜0.01).MiR-205过表达后A375和A2058细胞均由梭形、基质型向圆形、表皮型转化.与NC组相比,miR-205组细胞E-cadherin蛋白表达增加(P＜0.01),且表达E-cadherin的细胞数量和荧光强度均增加;Twist、intergrin、vimentin、Zeb1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低(P＜0.01).结论 MiR-205通过诱导E-cadherin的表达逆转上皮间质转化,从而抑制黑素瘤细胞的迁移和侵袭.     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用

目的探讨结核菌素对肝癌和肺癌肿瘤细胞生长和凋亡的调控作用。方法制备不同浓度的结核菌上清液(TB-SN),分别与肿瘤细胞株HePG2(肝癌)和A549(肺癌)进行反应。应用特异性荧光探针LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity试剂盒检测肿瘤细胞的生长情况,应用Vybrant凋亡试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡情况。结果与5%TB-SN反应5 d后,HePG2和A549细胞凋亡显著增加;与TB-SN反应后,HePG2和A549细胞生长受到抑制。结论结核菌素可以介导肝癌和肺癌肿瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的生长。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

小鼠DC、NK细胞体外诱导、增殖及示踪方法

目的研究小鼠自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)体外诱导增殖及其过继免疫后示踪的方法.方法建立C57BL/6小鼠皮下黑素瘤模型,体外诱导、增殖小鼠脾源性NK细胞及骨髓源性DC,进行电镜观察,并在体外以Brdu、DAPI标记,混合两种细胞回输荷瘤小鼠体内,观察肿瘤组织中两种细胞的示踪情况.结果DC、NK细胞在细胞因子诱导下体外成倍扩增,电镜下可见典型的DC、NK细胞.Brdu对细胞的标记率约65%,DAPI对细胞的标记率可达100%.在荧光显微镜下可见肿瘤组织切片中外源性DC、NK细胞的分布.结论Brdu、DAPI均可作为外源性细胞体内示踪的标记方法.     

猪血浆FN的分离及其性质鉴定

本文用明胶和肝素亲和层析柱等方法,从猪血浆中分离得到大量(0.5mg/ml)的纤维粘连蛋白(FN)。此FN在琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一条带,分子量约450000;巯基乙醇还原后呈现分子量约230000的两条带;可以与抗人和抗牛血浆FN抗体发生免疫沉淀反应;并具有强烈促CHO细胞贴壁活性。提示猪血浆是一种分离提取FN的良好资源。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。