甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法的建立

目的构建一种可同时检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2亚型流感病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法根据不同流感亚型HA与NA的差异,设计五对引物及五条探针,构建合适的检测体系,分析特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,并将其与常用检测试剂盒进行比对。结果本研究成功构建多重荧光RT-PCR检测体系,能同时检出甲型H1N1、季节性H1N1及H3N2亚型流感病毒,检测灵敏度为101~102拷贝/μl,可重复性好(变异系数为0.47%~4.03%),比常用检测试剂具有更好的荧光值水平,可适用于多种常见的荧光定量PCR仪。结论本方法所构建检测流感亚型体系具有较好的特异性、灵敏度、可重复性、仪器适用性,适用于各基层疾控及医疗机构。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

快速检测人新甲型H1N1、季节性和乙型流感病毒多重PCR方法的建立

目的 建立一种可以同时检测人类新甲型H1N1、季节性H1N1和H3N2亚型流感病毒及乙型流感病毒的多重PCR方法.方法 根据以上4种流感病毒的特异性基因设计4对引物,建立可同时扩增出4个流感病毒特异性片段的多重PCR的方法.用人的GAPDH基因作为内参判断标本来源和实施质量控制的依据.并进行敏感性、特异性和盲样检测评价实验.结果 该方法可同时扩增出流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为106 bp(新甲型H1N1)、135 bp(季节性H1N1)、118 bp(季节性H3N2)、170 bp(乙型流感病毒).该实验检测新甲型H1N1(A/colifornia/07/ 2009)的敏感性为102copies/反应.特异性实验结果显示每对引物只检测对应的病毒,32份盲样检测结果特异性好.结论 该多重PCR方法可同时检测新甲型H1N1及季节性流感病毒,敏感性、特异性强,可用于人类流感病毒的鉴别分型检测.     

568份疑似甲型H1N1流感病例标本病原学检测结果分析

目的对河池市568份疑似甲型H1N1流感病例标本进行核酸检测,为甲型H1N1流感疫情的防控提供依据。方法对疑似甲型H1N1流感病例标本用实时荧光定量RT-PCR法（Real-time RT-PCR）检测,检测项目为A型流感病毒核酸、B型流感病毒核酸和甲型H1N1流感病毒核酸,对A型流感病毒核酸阳性而B型流感病毒核酸和甲型H1N1流感病毒核酸均阴性标本再进行季节性流感病毒H1N1、H3N2亚型流感病毒核酸检测。结果检测疑似病例标本568份,其中甲型H1N1流感病毒核酸阳性334份,季节性流感病毒H1N1亚型核酸阳性14份,季节性流感病毒H3N2亚型核酸阳性25份,A未分型流感病毒核酸阳性40份。结论实验室检测为甲型H1N1流感疫情的确认、防控以及病人的处理提供了依据,对提高实验室检测技术的敏感性、特异性和实效性具有重要的意义。     

双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。     

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。     

定量实时PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒

目的:对采集来的疑似甲型H1N1流感患者咽拭标本进行核酸检测,不断摸索快速检测流感的PCR方法。方法:实验方法按照WHO标准的实时PCR(Real-time PCR)检测法操作,选取343份疑似甲型H1N1流感咽拭子采用实时定量核酸检测和快速分型。结果:在343份咽拭子标本检测结果中,甲型H1N1流感病毒核酸阳性为52份,阳性率15.16%,乙型流感病毒阳性11份,甲3型流感病毒阳性13份,甲1型流感病毒未检出。结论:实时PCR技术操作方法简便、耗时短、特异性强、灵敏度高,是一种适合应用于甲型H1N1流感病毒可靠、快速诊断的检测方法。     

甲型H1N1流感双重荧光PCR快速筛查方法的研究

目的 优化一种甲型H1N1流感的双重荧光PCR快速筛查方法.方法 根据WHO推荐的甲型H1N1流感检测方案合成、标记引物和探针.通过改进反应条件与参数,优化了甲型H1N1流感的双重荧光PCR检测方法.结果 该方法敏感度高,特异性强,重复性好.应用该方法检测患者实际样品,结果与WHO推荐方法的检测结果一致;应用该法可在4 h内完成对样品中甲型H1N1流感的检验.结论 本研究优化的甲型H1N1流感的双重荧光PCR快速筛查方法可用于甲型H1N1流感的诊断.     

树鼩腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的通过建立树鼩腺病毒(tree shrew adenovirus,TAV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,快速准确地检测树鼩腺病毒。方法根据TAV全基因组3’端保守序列设计合成特异性引物;用含目的基因片段的重组质粒作为标准品进行标准曲线绘制,建立TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TAV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应;方法的最低检测限度为每微升3.7拷贝,灵敏性强;相关检测系数R2为0.998,扩增效率为95.7%;扩增结果具有良好的线性关系,且重复性检测效果好。结论成功建立了TAV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,重复性好,可用于TAV感染的早期快速检测。     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析

【目的】 了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律｡【方法】 分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性HIN1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析｡ 【结果】 2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性HIN1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9% ~ 78.8 %),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979 ~ 2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1% ~ 79.3%),但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系最近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异｡【结论】 2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况｡     

检测甲型H1N1流感病毒富集方法的初步探索

目的探索甲型H1N1流感病毒的富集方法,提高流感病毒核酸检测的灵敏度。方法分别用ProteinA/G及H1N1特异性血清处理流感病毒样品,根据国家流感中心设计的H1N1亚型检测通用引物,采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法,扩增产物为527bp,来评价病毒的富集效果。结果两种富集方法均能提高检测灵敏度,用ProteinA/G富集处理后检测灵敏度可达10-6,用H1N1特异性血清沉淀富集处理后灵敏度为10-5。结论初步建立的富集甲型H1N1流感病毒方法,有效提高了流感病毒RT-PCR检测的灵敏度,可用于甲型H1N1流感病毒的检测。     

深圳地区新甲型H1N1（2009）流感病毒M基因特征分析

目的对深圳地区分离到的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因分子特性进行详细分析,并从分子水平上了解其对金刚烷胺类药物的耐药性。方法选取深圳地区分离培养到的55株新甲型H1N1（2009）流感病毒,对其M片段进行全长测序,采用DNAstar与MEGA3．1生物软件对M基因序列进行比对并用NJ法构建系统进化树。结果通过对M基因的氨基酸序列进行进化分析,发现深圳地区分离培养到的新甲型H1N1（2009）流感病毒更接近欧洲猪流感病毒,与季节性HINI流感病毒差异很大。经过序列分析发现,深圳株的M基因与A／California／07／2009高度同源,显示该病毒M基因较保守。此外,还发现所有深圳株的M2蛋白均出现s31N突变,显示对金刚烷胺类药物可能耐药。结论深圳流行的新甲型H1N1（2009）流感病毒的M基因可能源于欧洲猪流感病毒,且均对金刚烷胺类药物有耐药倾向。应进一步加强对新甲型H1N1（2009）流感病毒的分子特征研究,并积极开展流感病毒耐药性监测。     

人用甲型H1N1流感疫苗两种免疫方法动物免疫效果比较

目的：比较甲型H1N1流感疫苗0 d一针免疫方法与0、21 d二针免疫方法的免疫效果,同时观察季节性流感疫苗免疫后是否对甲型H1N1流感病毒具有交叉保护性。方法：用甲型H1N1流感疫苗分别按0 d一针及0、21 d二针2种免疫方法免疫BALB／c小鼠,首针免疫后14、21、28、35及42 d眼眶采血分离血清,用血凝抑制(HI)法测定小鼠血清中甲型H1N1特异性抗体滴度,比较2种免疫方法的免疫效果。用季节性流感疫苗免疫小鼠,14、28 d后采血分离血清,用甲型H1N1流感病毒特异性抗原采用HI法测定季节性流感疫苗抗血清是否能甲型H1N1流感病毒特异性抗原进行非特异性结合。结果：二针免疫的方法在第21天加强免疫一次后,第28、35及42天时抗体滴度明显高于一针免疫方法的抗体滴度,且第42天时的抗体滴度约为一针免疫方法抗体滴度的4倍。用甲型H1N1流感病毒特异性抗原采用HI法测定季节性流感疫苗抗血清,未测出甲型H1N1交叉抗体。结论：0、21 d二针免疫的方法在第28天后抗体滴度仍保持较高的水平,明显高于0 d一针免疫的方法。季节性流感疫苗对甲型H1N1流感病毒无交叉免疫保护性。     

实时荧光RT-PCR法快速检测流感病毒的应用研究

目的应用实时荧光RT-PCR快速检测2009～2012年河池市流感病毒核酸,为流感的预防控制提供科学依据。方法采集河池市哨点医院的流感样病例和暴发疫点现患病例的咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法进行流感病毒核酸检测分型。结果以实时荧光RT-PCR法检测2 090份标本,流感病毒核酸阳性801份,总阳性率为38.28%。其中甲型H1N1流感468份,B型126份,季节性流感H1亚型14份,季节性流感H3亚型109份。结论实时荧光RT-PCR法检测流感病毒具快速、操作方便、特异性强、灵敏度高等优点,值得推广应用。     

季节性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺适应株的建立及其分子机制

目的 建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株，并对适应的分子机理进行研究。方法 以病毒滴鼻感染小鼠，通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代，观察小鼠存活情况及肺病理改变，来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株。结果 季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株，经过在小鼠体内进行8次传代后，毒力逐渐增强，从无致病力到致死率达到100%，对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对，发现适应株HA基因发生了3个有义突变。结论 野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株，HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用。     

Gene expression profiles comparison between 2009 pandemic and seasonal H1N1 influenza viruses in A549 cells

Objective To perform gene expression profiles comparison so that to identify and understand the potential differences in pathogenesis between the pandemic and seasonal A （H1N1） influenza viruses. Methods A549 cells were infected with A/California/07/09 （H1N1） and A/GuangdongBaoan/51/08 （H1N1） respectively at the same MOI of 2 and collected at 2, 4, 8, and 24 h post infection （p.i.）. Gene expression profiles of A549 cells were obtained using the 22 K Human Genome Oligo Array, and differentially expressed genes were analyzed at selected time points. Results Microarrays results indicated that both of the viruses suppressed host immune response related pathways including cytokine production while pandemic H1N1 virus displayed weaker suppression of host immune response than seasonal H1N1 virus. Observation on similar anti-apoptotic events such as activation of apoptosis inhibitor and down-regulation of key genes of apoptosis pathways in both infections showed that activities of promoting apoptosis were different in later stage of infection. Conclusion The immuno-suppression and anti-apoptosis events of pandemic H1N1 virus were similar to those seen by seasonal H1N1 virus. The pandemic H1N1 virus had an ability to inhibit biological pathways associated with cytokine responses, NK activation and macrophage recognition .     

Viral shedding in Chinese young adults with mild 2009 H1N1 influenza

Background  The duration of viral shedding and the transmission of 2009 H1N1 influenza among individuals, especially among the younger population with mild illness, are not well understood now. The aim of this study was to determine the viral shedding of the young adult patients with mild 2009 H1N1 influenza in China.

Methods  From September 2009 to January 2010, the clinical data and serial nasopharyngeal swabs of 67 patients with 2009 H1N1 influenza and 37 patients with seasonal influenza aged from 18 years to 35 years were collected. The nasopharyngeal swab samples were detected by real time RT-PCR to determine the viral shedding. All the patients did not receive the antiviral therapy but Chinese medicine for detoxicating.

Results  Among the patients with H1N1 virus infection, 82.1% (55/67) patients presented with fever symptom, while more patients with high fever (≥39ºC) were found in seasonal influenza patients (P <0.05). For the H1N1 patients, the median interval between the symptom onset and the undetectable RNA was six days (4–10 days). But viral shedding was still found in 31.3% patients after 7 days following illness onset. The median interval between disappearance of fever and an undetectable viral RNA level was three days (2–8 days), and 17.9% patients were found to be viral shedding 6 days later after normalization of body temperature. For the seasonal influenza patients, 94.6% patients were detected out viral RNA within 7 days. The median interval of seasonal influenza between the symptom onset and the undetectable RNA was four days (3–8 days). The median interval between disappearance of fever and an undetectable viral RNA level was three days (2–6 days).

Conclusion  It suggests that 7 days isolation period from the illness onset or 24 hours after the resolution of fever and respiratory symptoms are not long enough to cut off the transmission among Chinese young adults with mild illness.