用精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的实验研究

目的：探讨精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的可行性。方法：构建乙肝病毒X基因表达载体pcDNA3-X;应用微量注射针将脂质体包裹的pcDNA3-X表达载体直接注入C57BL／6N雄性小鼠睾丸的曲细精管内，于第一次注射后6周，与雌鼠交配，用PCR法和免疫组化法检测仔鼠基因组中的外源DNA和肝组织中表达的pX蛋白。结果：测序结果与文献报道一致，并且X基因在Hela细胞中表达；共产仔鼠16只，其中1只为阳性仔鼠，阳性率为6．25％。结论：初步证明用精原干细胞介导法制备X基因转基因小鼠是可行的。     

树Qu的人工哺育

为探索和建立人工哺育树鼩的可行方法,将5对成年树鼩配对后饲养在繁殖笼内,喂与由标准动物粉状饲料、奶酪、新鲜蔬菜和水果构成的混合食物.新生树鼩出生后立即从母笼移出至孵育箱,每日人工喂与专门配制的牛奶制品.三周后将小树鼩从孵育箱移出,经喂与转换食物约10 d,过度到自食成年食物.结果7个月内5对成年树鼠句在共产11窝31只仔树鼩.在27只出生后人工喂养的仔树鼩中,25只健康存活至进入动物实验,人工喂养成活率为92.6%.树鼩平均产仔间隔52±8.9 d;平均窝产仔数2.8±0.4只.人工哺育树鼩的成功为提供树鼩应用于医学实验研究,尤其是与肝癌、肝炎有关的研究,开拓了广阔的前景.     

树鼩人工哺育初步研究

目的 采用人工哺育方法 ,避免人工驯养条件下树鼩不愿哺乳、食仔或母乳缺乏,提高仔树鼩的存活率,并使其正常生长发育. 方法 人工辅助母树鼩哺乳或配制人工乳哺乳.即人工保定母树鼩,侧卧,让其新生仔或其他寄养仔自行寻找乳头哺乳;如母树鼩产后缺乳或无寄养条件,配制营养丰富的代用乳人工喂养. 结果 25只仔树鼩经人工哺育方法 喂养存活19只,存活率为76%,体重增长与文献报道相似.而初始繁殖的13只仔树鼩经自然哺乳,仅存活2只.结论 已基本掌握仔树鼩的人工哺育方法 ,一定程度上为在实验室环境下大规模人工驯养繁殖树鼩提供了经验.     

HBV基因疫苗诱导正常及HBV转基因小鼠产生体液免疫应答

目的:用乙型肝炎病毒(HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答,以探讨其预防及治疗HBV慢性感染的可行性.方法:将HBV S2.S基因的真核表达载体pCMV-S2.S(PS)和相应的空载体pcDNA3.0分别免疫正常C57BL/6小鼠及同一品系HBV转基因小鼠(n=5).每只小鼠肌内注射纯化质粒100 μg.用ELISA方法检测小鼠血清抗HBs和抗preS2效价及HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg的水平.注射基因疫苗后第8周,活检取转基因小鼠肝脏组织,制备石蜡切片并行H-E染色,光镜下观察其病理改变.结果:PS诱导正常及转基因小鼠产生了抗HBs及抗preS2,并且抗preS2的出现早于抗HBs约1～2周.PS免疫8 周后,转基因小鼠血清HBsAg和HBeAg为阴性.注射基因疫苗后第8周病理检查转基因小鼠肝脏组织,肝细胞出现程度不同的广泛浊肿和水样变性,而相应的对照组无明显改变.免疫前后肝组织内单个核淋巴细胞数量无显著变化.结论:研究表明HBV中蛋白基因疫苗能够有效诱导HBsAg特异性的体液免疫应答,能够清除转基因小鼠血清中的HBsAg和HBeAg;初步的实验结果为研制治疗HBV慢性感染的基因疫苗提供了依据.     

慢性非细菌性前列腺炎动物模型的研究进展

目的 采用人工哺育方法 ,避免人工驯养条件下树鼩不愿哺乳、食仔或母乳缺乏,提高仔树鼩的存活率,并使其正常生长发育. 方法 人工辅助母树鼩哺乳或配制人工乳哺乳.即人工保定母树鼩,侧卧,让其新生仔或其他寄养仔自行寻找乳头哺乳;如母树鼩产后缺乳或无寄养条件,配制营养丰富的代用乳人工喂养. 结果 25只仔树鼩经人工哺育方法 喂养存活19只,存活率为76%,体重增长与文献报道相似.而初始繁殖的13只仔树鼩经自然哺乳,仅存活2只.结论 已基本掌握仔树鼩的人工哺育方法 ,一定程度上为在实验室环境下大规模人工驯养繁殖树鼩提供了经验.     

系统表达HB-EGF转基因小鼠的建立

目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用显微注射的技术把表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立HB-EGF转基因小鼠。利用特异引物PCR的方法鉴定转基因的基因型,采用Western Blot方法鉴定HB-EGF基因在全身组织的表达。分别取HB-EGF转基因鼠与同窝阴性小鼠的肝、肾、肺及膀胱组织进行Massion染色。结果建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,Western Blot发现其HB-EGF在肝、肺、肾及膀胱的表达与同窝阴性对照小鼠相比明显增加。Massion染色结果表明转基因鼠肝、肺、肾及膀胱组织纤维化程度明显高于同窝阴性对照小鼠。结论成功建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,HB-EGF的过度表可显著加重组织纤维化程度。     

NPC1L1在树鼩AS造模中小肠和肝的表达及意义

目的探讨建立树鼩AS模型中NPC1L1(Niemann-Pick C1-Like1)基因在小肠和肝中mRNA的表达差异.即树鼩脂质代谢和动脉粥样硬化的关系.方法通过半定量RT-PCR分别检测树鼩不同膳食组间小肠、肝组织中的NPC1L1 mRNA表达差异.结果高脂饲料组树鼩肠组织中基因NPC1L1 mRNA的表达(3910±262)μmol/L,与正常饲料组比较(P<0.05),表达水平显著高于正常饲料组.结论树鼩消化道组织NPC1L1表达增加与脂肪代谢小肠组织中NPC1L1的高表达有关,NPC1L1可能参与了血脂紊乱的病理生理过程,NPC1L1与促成动脉粥样硬化的发生机制有待进一步研究.     

供乙肝疫苗质检用的新动物模型——乙肝疫苗预防树鼩感染HBV的研究

接种乙肝疫苗的10只树鼩,9只血清出现抗-HBs。注射含HBV的人血清后,其中只有1只血清出现短暂的HBsAg,保护率为88.88％;其血清抗-HBc始终阴性。未接种乙肝疫苗的10只对照树鼩注射HBV人血清后,5只血清HBsAg阳性;8只抗-HBc阳性。接种疫苗组HBV感染率显著低于对照组(p<0.01)。实验前所有树鼩血清HBsAg、抗-HBs及抗-HBc均阴性。实验结果表明:1)乙肝疫苗能阻断树鼩感染HBV,进一步确证树鼩能感染HBV,是用于研究HBV的有用的动物模型;2)树鼩可能代替黑猩猩进行乙肝疫苗安全性和免疫保护效果鉴定之用。     

乙型肝炎动物模型的研究

目的建立树鼩和熊猴的乙肝动物模型.方法用含HBV的人血清接种给7批30只熊猴,6批233只树鼩,每周定期采血、定期肝组织活检.用改良赖氏法、ELISA、PCR、原位杂交、免疫组化分别检测血清ALT、HBV标志物、HBV-DNA及肝组织中HBsAg和HBV-DNA.结果树鼩接种人HBV(HHBV)后,90%呈急性感染,56%为可持续1年以上的慢性感染,33%持续2年2月,肝细胞内HBsAg阳性率达80%,熊猴接种HHBV后,血清HBV标志物呈一过性,个别猴肝细胞内HBAg呈弱阳性.结论熊猴对HHBV并不敏感,而树鼩对HHBV感染有较高的敏感性,有望成为HHBV的动物模型.     

糖尿病树鼩肝脏病理分析

目的 对注射链脲佐菌素（STZ）8周后糖尿病树鼩动物肝脏进行病理分析。方法 将树鼩随机分为正常对照组和STZ处理组；静脉注射STZ，共持续8周给药，根据血糖水平，再分为糖尿病组（血糖≥11．1mmol／L）和STZ对照组（血糖〈11．1mmol／L）。分别于成模前和成模后4、8周测定3组动物的血清ALT、AST、IV—C、LN和HA。8周末行肝组织活检，经HE、PAS、D—PAS及Masson染色后光镜下观察。用病理图像分析系统对肝脏胶原纤维面积密度进行分析。以透射电镜观察肝超微结构。结果 注射STZ8周后糖尿病模型动物出现早期肝纤维化的电镜及光镜病理组织学变化。结论 糖尿病树口动物模型注射STZ8周后可出现早期肝纤维化病理改变。     

乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析

构建ＨＢＶ核心抗原ＤＮＡ疫苗,并探讨基实验动物内的表达及其免疫原性。方法：采用ＰＣＲ法从ＨＢＶ全基因ＤＮＡ中获得核心抗原ＤＮＡ片段,并将其重组到ｐｃＤＮＡ３载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树Ｊｕ,并检测其抗ＨＢｃＩｇＧ。结果：构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＢｃ。免疫接种该疫苗后第２周抗ＨＢｃＩｇＧ水平开始升高,小鼠至第９周,树Ｊｕ至第７周升至峰值。结论：构建ｐｃＤＮＡ３－ＨＢＣｄ     

HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建

目的：通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法：用Oliga6．0结合Primer Premier5．0软件设计特异性引物，通过PCR方法从广西HBsAg阳性病人血清中（血清型Adrq^＋）分离得到的病毒株构建的HBxAg质粒中扩增HBx基因。用DNA star5．01和Vector NTI Suite8．0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）质粒中。结果；成功克隆了基因型C型突变型HBx基因，并构建出真核表达载体pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明．新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的变异。结论：从广西HBsAg阳性病人病毒株（血清型Adrq^＋）中发现了新的基因型C型突变型HBx基因（mutantgenotypeC）。peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，将为进一步研究HBx基因在树鼩实验性肝癌诱发过程中所起的作用打下基础。     

实验感染乙型肝炎病毒的树鼩血清HBsAg及抗-HBs的表现类型

57只实验树鼩接种HBV后,用分子杂交技术、电镜及肝组织免疫酶标方法检测,有39只证实已获感染.这39只动物血清HBsAg及抗-HBs(PHA)表现有6种形式,与人感染HBV后的表现形式相似.表明树鼩是可用于HBV实验感染研究的较好的动物.     

树鼩部分信号转导通路的相关cDNA芯片的建立

目的：建立树鼩部分信号转导通路的相关cDNA芯片，从而进一步探讨肝细胞癌（HCC）发生的分子机制。方法：在基因库中找出人的信号转导通路相关基因mRNA序列，选取其中与大、小鼠高度同源的片段，设计出相关的引物序列，然后用树鼩正常肝组织的cDNA为模板经PCR扩增出树鼩相应基因的cDNA片段，将这些cDNA片段作为树鼩的特异性探针，进而建立起树鼩部分信号转导通路的相关cDNA芯片。结果：得到涉及信号转导通路相关基因的探针共有152个基因。结论：利用该芯片研究树鼩HCC发生过程中信号转导通路中的作用将有重要的实用价值，从而完善树鼩肝癌动物模型的研究。     

pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与乙型肝炎病毒（HBV）preS1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法采用PCR方法 ,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBVpreS1基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1-GFP,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用PCR技术检测HBVpreS1基因的存在与表达情况。结果成功构建了pcDNA3.1-preS1-GFP真核表达载体,将其转染小鼠精子后,在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光,PCR扩增得到位于HBVpreS1基因区域内长约589bp的片段。结论重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP的成功建立及其在小鼠精子内的表达,为建立新的HBVDNA垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。     

树Qu对丙型肝炎病毒的易感性研究

目的：探讨树Ｑｕ对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的易感性。方法：对来自云南的树Ｑｕ接种含ＨＣＶ的病人血清,然后用ＰＣＲ方法检测树Ｑｕ血清的ＨＶＣ ＲＮＡ,用反向被动血凝法测定抗－ＨＣＶ抗体,用原位ＰＣＲ方法检测树Ｑｕ肝细胞内的ＨＶＣ ＲＮＡ。结果：３４．８％的树Ｑｕ（８／２３）在接种ＨＣＶ后,血清中检出ＨＣＶ ＲＮＡ,对４例抗ＨＣＶ阳性和谷丙转氨酶升高的树Ｑｕ的肝组织进行原位ＰＣＲ检测,结果在１例肝细胞中     

乙肝DNA疫苗pVAX-PS对树(鼠句)的免疫保护作用

目的:以树(鼠句)为实验对象研究乙肝DNA疫苗接种后所产生的免疫应答及对乙肝病毒攻击的保护作用.方法:以PCR法从adr亚型乙肝患者血清的病毒基因组中扩增含乙肝病毒的PreS2+S基因,插入pVAX1载体构建乙肝DNA疫苗pVAX-PS,并以此为候选疫苗,从股四头肌接种免疫树(鼠句).免疫接种方式为肌注2次,间隔2周.用ELISA法分析DNA免疫诱导的抗体水平及阳转率.DNA免疫后部分树(鼠句)用乙肝患者(HBsA+,HBeAg+,HBcAb+)血清进行病毒攻击实验,通过检测乙肝感染的各种血清学指标及肝组织病理的变化来评价DNA疫苗的免疫保护作用.结果:DNA疫苗免疫2周后开始检出HBsAb,6周后达到峰值,8周后所有免疫接种树(鼠句)抗体阳转;与阴性对照组相比,DNA疫苗免疫使乙肝病毒攻击所致的各项血清学指标阳转率明显降低,肝脏病理性损伤明显减轻.结论:乙肝DNA疫苗pVAX-PS免疫树(鼠句)后诱发明显的体液免疫应答,并对乙肝病毒感染提供有效的保护作用.