基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义

目的：快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因（CYP6N3）上游启动子区序列。方法：根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′－末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物（GSP1和GSP2）,利用4种限制性内切酶Dra I、EcoRV、PvuⅡ和Stu I分别消化白纹伊蚊溴氰酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库（DL1、DL2、DL3及DL40,并分别以此为模板,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增。结果：第1步PCR结果显示：在上述4种消化文库中分别扩增出约806、2190、2206和3076bp的特异条带;第2步PCR结果与第1次PCR相类似,但各泳道主带扩增效率明显升高。结论：本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其4种限制性内切酶图谱。此外还对基因步移法是在昆虫细胞色素P450多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论。     

蚊虫细胞色素P450基因系列研究

报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因(CYP450)系列研究结果,包括①通过简并引物PCR分别从致倦库蚊、白纹伊蚊及中华按蚊中获得3个、2个、2个CYP4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT-PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得了白纹伊蚊CYP6家族3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列.GenBankaccessionnumber分别为AF283836-AF283838(全长cDNA序列)和AF284782-AF284783(非全长cDNA序列),被国际P450命名委员会正式命名为CYP6N3v1-v3(全长cDNA序列)和CYP 6N3v4、CYP6N4v1-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3 076 bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP 6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CYP6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性,并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标.     

蚊虫细胞色素P450基因系列研究

报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因（CYP450）系列研究结果,包括：①通过简并引物PCR分别从卷库蚊、白纹伊纹及中华按蚊中获得3个、2个、2个CPY4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT－PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增（RACE）法获得了白纹伊蚊CYP3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列。GenBank accession number分别为AF283836－AF283838（全长cDNA序列）和AF284782－AF2847830（非全长cDNA序列）,被国际P450命名委员会正式命名为CYP 6N3vl-v3（全长cDNA序列）和CYP 6N3v4、CYP6N4vl-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白蚊伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3076bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示：昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CPY6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示：蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标。     

白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因分子进化机制初探

为了初步探讨白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6家族新基因分子进化机理,根据已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株一新的细胞色素P450CYP6基因cDNA片段,设计反向引物,进行5’-cDNA末端快速扩增（rapid　amplification　of　cDNA　ends,RACE）;以正向引物进行3’-RACE。然后分别进行克隆、测序和鉴定。根据获得白纹伊蚊CYP6家族新成员全长cDNA序列,运用PC/GENE软件分析其5’-UTP区DNA序列相似性及编码区氨基酸残基相似性、构建系谱树。结果获得的3个全长序列中5’-UTP区DNA序列完全相同;编码区氨基酸残基相似性为3/497或4/497个氨基酸差异,而且此种差异均位于蛋白质功能非保守的基因区域;构建的系谱树显示CYP6N3基因与冈比亚按蚊CYP6N1-2亲缘关系最近,而与致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1亲缘关系较远。说明白纹伊蚊CYP6N3基因较致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1基因更为古老;白纹伊蚊CYP6N3各等位基因变异体是通过整个CYP6N3基因座的新近复制而产生。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因cDNA片段的克隆与鉴定

目的 获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因家族中的一个cDNA片段。方法 根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,进行反转录PCR,获得一大小与设计的细胞色素P450基因片段相符合的cDNA片段。将该片断与pUC19质粒重组,并克隆至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序;将推导的氨基酸序列进行同源性分析,并用PC/GENE软件绘制系统树。结果 获得了1条长240　bp的核酸序列;所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间,但CYP6D1除外,其同源性为29.1%;而与CYP4家族同源性较低,与CYP4C1、CYP4D1、CYP4D2同源性分别为33.3%、32.9%和29.9%;与哺乳动物CYP3A亚家族同源性亦较高;所绘制的系统树显示出与同源性分析相一致的结果。结论 该序列为CYP6家族中某一成员的结构基因片段。     

白纹伊蚊实验室抗溴氰菊酯品系筛选及其形态变化和钠通道基因分析

目的揭示实验室内白纹伊蚊溴氰菊酯抗性汰选中蚊抗性发展趋势、形态表型和蚊击倒抗性相关钠离子通道(VGSC)结构域Ⅲ基因片段(Kdr)的变化。方法实验室严格控制饲养条件,用溴氰菊酯汰选白纹伊蚊至30代,计算幼虫半数致死浓度(LC50)并获得抗性倍数(RR),成蚊接触筒法计算成蚊死亡率。随机选取汰选白纹伊蚊抗性株及敏感株的雌蚊,测量成蚊的体长等8个形态学指标,并对所测形态指标数据进行统计分析。PCR扩增抗性株及敏感株雌蚊钠通道结构域Ⅲ基因片段,TA克隆,测序,进行序列分析。结果经过汰选,抗性株的LC50由0.020 mg/L变成0.048 mg/L,其抗性倍数为2.4倍。幼虫生物测量结果显示抗性株具有低度抗性,成蚊抗药性生物测试表明R-20代白纹伊蚊为抗性群体,且抗性级别为R。18代白纹伊蚊抗溴氰菊酯株(R)与敏感株(S)的体长、前腿长、中腿长、后腿长、翅长、翅宽、触角长和喙长均数差异有统计学意义(P0.05)。随着代数的增加,白纹伊蚊抗性株在形态学各方面指标的均数呈现降低的趋势。测序显示,Kdr第96、132、204个位点碱基敏感株为C,而抗性株则突变为T;第111位敏感株碱基为A,抗性株则为G;第534位抗性株碱基由T突变为C。然而,敏感株及抗性株均未发现上述位点的氨基酸序列突变,未影响其蛋白质的表达。结论实验室内采用溴氰菊酯抗性汰选抗性白纹伊蚊模型成功。溴氰菊酯汰选抗性白纹伊蚊形态表型发生变化,溴氰菊酯汰选抗性白纹伊蚊的19代、20代蚊Kdr基因一些位点发生碱基突变,但对应的氨基酸序列没有改变。     

白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的克隆与生物信息学分析

目的应用简并引物RT．PCR和RACE方法获取白纹伊蚊Rh类糖蛋白（Aedes albopictus rhesuslike glycoprotein,AaRh）基因的全长cDNA。方法根据冈比亚按蚊、埃及伊蚊等亲缘关系较近物种的Rh类糖蛋白同源性分析结果,在氨基酸高度保守区域184／343和219／337氨基酸位点设计2对简并引物,以白纹伊蚊雌蚊总RNA为模板,应用巢式RT—PCR扩增AaRh的基因片段。根据获得的AaRh基因部分序列,设计2对特异性引物AaRhGSP1、GSP2和AaRhGSP3、GSP4,应用5’RACE和3’RACE分别扩增AaRh基因的5’端和3’端cDNA片段,然后拼接出全长cDNA序列。通过在线生物信息学分析（NCBI和Expasy）,对目的基因序列进行生物信息学分析。结果应用2对简并引物进行巢式RT-PCR．获得379bpAaRh基因片段。应用5’RACE和3’RACE方法,分别获得AaRh基因5’端1008bp、3’端822bpcDNA序列,根据两个片段的首／尾共同序列拼接为1717bp的基因片段。该核苷酸序列经BLASTn分析显示,与埃及伊蚊Rh蛋白的一致性高达95％,鉴定其为白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因。AaRh基因具有完整的开放阅读框,其ORF从第128位到1516位含1389bp,编码462个氨基酸。Expasy在线生物信息学程序分析显示,白纹伊蚊Rh类糖蛋白是一个整合膜蛋白,跨膜11次,58aa．446aa具有铵离子通道的结构功能域;理论等电点（pI）5．37,分子量49775．10Mr,laa-26aa可能为分泌信号肽序列;含有4个潜在的天冬酰胺糖基化位点和17个线性抗原决定簇,翻译后可能进行糖基化修饰,提示其为糖蛋白。结论成功获取AaRh基因的全长cDNA,生物信息学分析结果为AaRh蛋白的生物学特性和功能研究奠定了基础。     

联合PCR技术克隆白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因及其生物信息学分析

目的测定白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶的基因的全长序列并用生物信息学方法分析其结构和功能。方法从白纹伊蚊卵、幼虫、蛹、雌蚊、雄蚊中提取总RNA,逆转录后以总cDNA为模板,设计简并引物进行巢式PCR,扩增部分序列后设计新的特异性引物补全5’端序列,使用3’-RACE法补全3’端序列,拼接全长后进一步进行生物信息学分析。结果通过巢式PCR扩增出1145bp的核苷酸序列,测序后设计5’端序列的下游引物,扩增出约900bp的核苷酸序列,设计3’端的上游引物,配合3’RACE试剂盒扩增出约600bp的核苷酸序列,寻找重复序列将三段序列进行拼接,得到国内外从未获得的长2244bp、编码747个氨基酸序列的白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因的全长序列。生物信息学分析其与白纹伊蚊的相似性最高,为含信号肽的跨膜蛋白,含3个Cu氧化酶超家族位点,属于蓝色多铜氧化酶家族。结论联合PCR技术的应用使较长长度的基因序列的扩增更为方便、准确。为进一步对其进行功能的研究奠定了基础。     

白纹伊蚊防御素基因的体外扩增及鉴定

目的 克隆白纹伊蚊的防御素基因并对其进行序列分析。方法 提取白纹伊蚊基因组DNA，根据埃及伊蚊防御素基因序列设计合成引物，PCR产物克隆到T载体中进行测序和分析。结果 从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出了约375bP的片段，PCR产物经测序后与已发表的埃及伊蚊防御素基因比较，具有很高的同源性。结论 克隆了白纹伊蚊的防御素基因，为下一步蚊虫防御素蛋白的研究莫定了基础。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

十二指肠损伤的治疗体会

目的：提高十二指肠损伤的诊治水平，方法：回顾总结该院1999年－2001年间收治的十二指肠损伤7例临床经验。结果：合并其他腹部脏器损伤86％（6／7），单纯十二指肠损伤14％（1／7）。损伤部位以十二指肠降部为多占71％（5／7），水平部和球部各占14％（1／7），术后并发症发生率28％（2／7）、病死率14％（1／7）。结论：掌握十二指肠损伤的特点，早诊断、早手术、术中认真探查，掌握好检查指征，选择合理恰当术式，加强术后管理，可提高治愈率。     

断指再植的护理体会

随着医疗水平的提高,显微手外科技术在各基层医院已得到广泛开展,所收治的此类患者在逐年增加.随机统计了近两年我院20份34指的病例,通过观察认为手术的成功与否不但取决于损伤的局部条件、术中的操作和术后的治疗,同时与术前、术后的护理也密不可分.对离断指及伤口的妥善处理,积极的术前准备和术后的精心护理,特别是术后对血运的密切观察,同时通过术前术后的健康教育使患者对该疾病的知识有了一定的掌握,认识了康复训练的重要性从而使功能达到最大限度的恢复.     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

法乐氏四联症的外科治疗34例分析

目的：总结法乐氏四联症外科治疗经验。方法：共34例，年龄2～16岁，32例在中低温体外循环、胸部正中切口行法乐氏四联症根治术，1例在非体外循环下行改良B-T分流术，1例行根治术同时行双向Glenn分流术。结果：术后早期死亡1例，死亡原因为低心排综合征，无远期死亡。结论：本症应争取早日行根治术，肺动脉发育差者应行改良B-T分流术，右室发育不良者在行根治术同时行双向Glenn分流术，死亡原因以低心排综合征多见，应采取合适的手术方式及围术期多种方法预防。     

上颌骨牙源性囊肿刮除手术的疗效观察

目的探讨对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术的临床疗效。方法对我科在2010年1月～2017年9月收治的73例上颌骨牙源性囊肿患者行囊肿彻底刮除手术治疗,对患者术区肿胀消退、术后伤口感染、伤口愈合、牙龈再附着、术后复发、骨质改建、骨质修复等情况随访观察。结果 73例患者术后肿胀消退时间为1～4 d。73例患者术后均未发生伤口感染,伤口均一期愈合。所有患者牙龈再附着情况好,术后均未见复发。术后未见并发症。骨质改建效果好,骨质修复的效果因影像学资料过少,缺乏客观依据,暂不下有效结论。结论对上颌骨牙源性囊肿患者进行囊肿彻底刮除手术,术后患者的恢复情况良好,值得在临床治疗上进行推广。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。