非标记定量法对乙醇诱导肝损伤的蛋白质组学研究

目的运用基于质谱的非标记定量法探讨乙醇处理的肝癌细胞蛋白质组学的变化。方法将乙醇诱导损伤的肝癌细胞Hep G2在溶液内酶解,通过液质联用(LC-MS)检测酶解肽段,应用非标定量软件Progenesis LC-MS分析蛋白表达的差异,差异蛋白进一步应用蛋白分析数据库Panther 9.0和String 9.1统计分析。结果 Progenesis LC-M S分析显示,有309个检测到的蛋白质含量存在显著差异,Panther统计表明,这些差异蛋白包含各种催化酶类、细胞信号通路蛋白和结构蛋白等,涉及凋亡、免疫应答等细胞内的重要的生理反应,String显示这些蛋白间存在密切的相互联系。结论基于质谱的非标定量检测法可以为乙醇诱导的肝损伤机制研究提供依据与参考。     

非梗阻性无精子症患者精浆蛋白质组学研究

背景 非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是男性不育患者中十分严重的一种情况,目前其病理生理学机制未完全明确。目的 应用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)定量蛋白组学技术分析非梗阻性无精子症NOA患者精浆蛋白组学,初步探索NOA相关的候选生物标志物。方法 纳入2020年10月-2022年1月解放军总医院第一医学中心门诊行精液常规分析的NOA患者21例,按性激素水平分为原发性性腺功能减退(primary hypogonadism,PH)组(12例)、继发性性腺功能减退(secondary hypogonadism,SH)组(6例)和性激素水平正常组(NH组,3例),使用Label-free质谱技术对患者精浆进行蛋白质鉴定和相对定量。采用Proteome Discoverer软件对结果进行搜库鉴定,并对差异蛋白进行生物信息学分析。结果 在检测到的1 144种蛋白质中,与性激素水平正常组相比,原发性性腺功能减退组有32个上调差异蛋白和8个下调差异蛋白,继发性性腺功能减退组有14上调差异蛋白和99个下调差异蛋白;与继发性性腺功能减退组相比,原发组...     

定量蛋白质组学分析SDF2L1过表达后鼻咽癌细胞中的差异蛋白

目的：分析基质细胞衍生因子2样1(SDF2L1)过表达对人鼻咽癌（NPC）细胞5-8F中蛋白表达谱的影响。方法：提取SDF2L1基因过表达细胞株（5-8Fg）及空载细胞株（5-8F1）的总蛋白,利用非标记定量（LFQ）蛋白组学技术和串联质谱分析技术筛选差异表达蛋白（DEPs）,应用R软件对DEPs进行GO和KEGG富集分析,Cytoscape软件筛选关键的DEPs,Oncomine数据库对关键DEPs进行验证,RT-qPCR和western blotting法对筛选出来的关键DEPs进行验证。结果：在5-8Fg细胞中共筛选出730个DEPs,其中296个DEPs上调,434个DEPs下调。富集分析结果显示,DEPs主要定位在核糖体中,参与核糖体合成和内质网蛋白加工等过程,发挥黏附蛋白和催化活性等功能。通过Cytoscape和Oncomine数据库验证出核糖体蛋白L14(RPL14)、RPS15A等9个关键DEPs。SDF2L1过表达后RPL14基因（P<0.05）表达下调。结论：SDF2L1过表达后显著改变了NPC细胞中的蛋白表达特征,RPL14可能是NPC的促癌因子。     

蛋白质组学技术在营养学研究中的应用

蛋白质组学技术有助于人类深入研究食物蛋白质活性成分、揭示营养素代谢与调控机制、进行营养评价和营养相关疾病的生物学标记等,在营养学研究中具有广泛的应用前景。笔者就蛋白质组学技术在营养学中的应用进行了综述。     

蛋白质组学在糖尿病研究中的应用

随着人类基因组计划的提前完成,人们逐渐认识到基因只是遗传信息的载体,而生命活动的本质却是不同功能蛋白质在时间和空间上有序和协同作用的结果,蛋白质才是生理功能的执行者,生命的存在形式和活动规律直接依赖于蛋白质。约98％的疾病与蛋白质的表达有关。在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的。传统的对单个蛋白质的研究方式已无法满足后基因组时代的要求,必须在整体水平上对蛋白质进行研究。2001年《Science》已把蛋白质组学列为六大研究热点之一。     

蛋白质组学在肝癌研究中的应用

肝癌是世界上流行最广的恶性肿瘤之一,但发病机制至今仍不明了,且缺乏有效的早期诊断方法和治疗靶点。随着人类基因组计划的实施和推进,生命科学研究已进入了后基因组时代。研究的重点从基因组学转向蛋白质组学(proteomics)。蛋白质组学将成为研究肿瘤及相关疾病的最有效方法之一。本文着重就蛋白质组学在肝癌研究的应用作一综述。     

蛋白质组学技术在癌症相关研究中的应用

寻找理想的表型生物标志物,阐明疾病发生、发展过程中起关键作用的蛋白质分子以用于癌症的早期检测诊断及预后评估一直是癌症研究领域的热点和难点。随着人类基因组测序的完成,癌症研究的重点从基因组学转移到蛋白质组学研究中,癌症研究中的差异蛋白质组学技术也飞快发展,极大推动了与癌症相关的差异蛋白质组学研究,本文综述了近年来蛋白质组学技术在与癌症相关研究中的一些应用。     

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

目的 建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础.方法 将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学.结果 通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段.随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5% ～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05).结论 iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础.     

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

目的 建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础.方法 将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学.结果 通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段.随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5% ～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05).结论 iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础.     

蛋白质组学在糖尿病研究中的应用

当今分子生物学领域内,蛋白质组已成为研究的热点。基因组相对较稳定,而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征;蛋白质组是动态的,随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使人类更容易接近对生命过程的认识。简要介绍蛋白质组学这一新兴学科的基本概念和技术流程,着重阐述其在糖尿病的研究进展。     

非标记型适配体传感器对石房蛤毒素的高灵敏度检测

目的 建立了一种基于荧光染料噻唑橙(thiazole orange,TO)和核酸适配体的非标记型适配体传感器,可快速、灵敏地检测石房蛤毒素(saxitoxin,STX)。方法 本研究中使用经过变形处理的直链适配体 45e-1能够特异性识别并结合STX,形成了稳定的G-四链体复合物。TO自身以游离态存在于水溶液中时几乎没有荧光发射,但通过与G-四链体的小凹槽结合产生荧光。因此,TO可作为荧光探针,用于指示45e-1与STX结合后产生的构象变化从而达到定量检测STX的目的。 结果 在最佳实验条件下,荧光信号强度变化与STX浓度呈正相关关系,拟合线性方程为Y = 3639.8lgCon_STX + 2341.5(R₂ = 0.9725),检测限为0.67 nmol/L,对其他常见海洋毒素的交叉反应可以忽略。在海水中,该方法的加标回收率为90.7%–108.7%,RSD为7.1%–10.9%。结论 本研究建立的非标记型适配体传感器可以实现对STX的定量检测,并且具有良好的特异性和重现性,为准确、快速检测其他海洋毒素提供思路。     

胰腺癌早期诊断的蛋白组学研究进展

肿瘤早期诊断的蛋白组学研究是近来国内外研究的热点。本文综述了胰腺癌早期蛋白质组的改变在胰腺癌早期诊断的作用,为胰腺癌的早期诊断提供科学手段。     

RNA干扰技术在蛋白质组学研究中的应用

 人类基因组测序的完成宣告人类已经进入后基因组时代,此后的一个重要任务就是从蛋白质水平对基因的功能进行验证,高通量的蛋白质组（proteome）研究方法应运而生,为筛选有价值的生物蛋白标记提供了有效的方法;而RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术近年来亦已成为研究基因表达功能的强有力工具之一,它可在转录水平对蛋白质的表达进行调控,这两种新兴研究技术的已经互相成为重要的补充。本文将在简介蛋白质组技术、RNAi技术后,对RNAi在蛋白质组学研究中的现状简要作一综述。     

鼠痘病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

目的 建立鼠痘病毒的荧光定量PCR检测方法,以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法 经过比对和筛选,本研究选取鼠痘病毒的ERPV_027基因480-800位序列段,作为引物设计位点设计引物和探针,并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果 本研究建立的方法,对鼠痘病毒的检测极限是68.8copies/μl;该方法特异性强,只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增,而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增;该方法稳定性和重复性均较好。结论 本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量PCR方法,该方法特异性强、灵敏度高,且具有较好的稳定性和重复性,具有广阔的应用价值。     

小胶质细胞蛋白质组三维分离方法的建立

目的:建立基于二维液相色谱法的三维分离小胶质细胞蛋白质组的方法.方法:将小胶质细胞裂解后制备全细胞蛋白,在传统的一维HPCF、二维HPRP分离后,增加了三维SDS-PAGE电泳,对小胶质细胞实现了三维分离.结果:经过优化后的三维分离,小胶质细胞全蛋白按照pH值由高到低的顺序分为34个组分,其中pH 8.5～4.0的部分包含16个组分,每一个组分又包含若干种蛋白质.结论:同传统的二维液相色谱分离方法相比,改进后的三维分离方法对小胶质细胞全蛋白具有更彻底、更好的分离效果,为后续的质谱鉴定提供了分离度更好的样品.     

鼠痘病毒荧光定量Taqman-PCR检测方法的建立与应用

目的 建立鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR检测方法, 以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法 经过比对和筛选, 本研究选取鼠痘病毒的ERPV_027基因480-800位序列段, 作为引物设计位点设计引物和探针, 并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果 本研究建立的方法, 对鼠痘病毒的检测极限是68 copies/μL;该方法特异性强, 只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增, 而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增;该方法稳定性和重复性均较好。结论 本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR方法, 该方法特异性强、灵敏度高, 且具有较好的稳定性和重复性, 具有广阔的应用价值。     

黏细菌总蛋白质组双向电泳条件的建立

目的 :建立可以对黏细菌蛋白质组进行阵列分离的双向电泳条件。方法 :以黏细菌模式菌株DK162 2为材料 ,不同方法制备DK162 2在营养性生长阶段的蛋白质组样品 ,双向电泳阵列菌体总蛋白。通过不同条件下电泳图谱的比较建立蛋白质组样品的制备方法和双向电泳的技术条件。结果 :两性离子去污剂CHAPS及还原剂的浓度是影响双向电泳图谱分辨力的重要因素 ;蛋白质组样品的处理必须在低温下快速完成 ,以避免蛋白降解。结论 :初步建立了黏细菌总蛋白质组的双向电泳条件 ,为在细胞水平分析该模式生物发育时期蛋白表达谱奠定了基础     

FscB蛋白在鼠精子发生过程中的动态表达和迁移研究

目的:探讨一种新的睾丸特异性蛋白FSCB(Fibrous sheath CABYR binding protein)在精子内的精细动态表达和迁移过程,并研究该蛋白在正常和畸形精子中的形态定位特征.方法:应用过碘酸-希夫氏染色获得鼠睾丸曲精小管上皮中精子发生的时相性背景特征,然后应用间接免疫荧光方法对FSCB蛋白在睾丸和精子内的动态表达和迁移过程进行观察.结果:FSCB最初表达于长精细胞的第11步(时相Ⅺ),呈胞浆内弥漫性染色;随之从第11步(时相Ⅺ)至第15步(时相Ⅵ)表达逐渐加强;在精子形成的第15步(时相Ⅳ至时相Ⅵ)FscB开始向精子鞭毛迁移,最终于第16步(时相Ⅷ)FSCB蛋白整体局限定位于睾丸精子鞭毛上,胞浆内荧光染色消失.进一步研究显示该蛋自在正常精子中定位于鞭毛主段、精子头部、鞭毛颈段、中段和末段均无表达.在畸形精子中,该蛋白表达存在3种异常改变:①鞭毛内无阳性表达;②表达节段前移并缩短,提示这类精子缺乏中段;③呈现间断分布的串珠状改变.结论:FSCB是纤维鞘的重要组成蛋白,在精子纤维鞘形成的后期装配于其表面,可能是纤维鞘生物合成的最后装配步骤.该蛋白在畸形精子中存在明显表达异常,其表达异常与精子运动功能之间的关系有待深入研究.     

类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞的差异蛋白质谱分析

目的 应用双向凝胶电泳-质谱法分析正常人及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者滑膜成纤维细胞蛋白质组表达差异,探讨差异蛋白在类风湿关节炎发病中的作用.方法 采用固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离正常人及类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞总蛋白质,银染显色,PDQuest软件分析图像,比较两种细胞蛋白质组表达差异,对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定,并用Western blot验证部分表达差异蛋白质.结果 ①采用窄范围的pH 4～7 IPG胶条进行2-DE分析,正常人及RA患者滑膜细胞蛋白胶图上分别平均显示852、837个点.有49个蛋白点在正常、RA滑膜细胞间有2倍以上的显著性量变.②分别在胶图上共选取40个表达水平存在明显差异的蛋白质点进行质谱鉴定,鉴定出23个在RA患者滑膜细胞中表达上调蛋白质.Western blot验证Enolaseα、Annexin Ⅰ、Cathepsin D、SOD2、Peroxiredoxin 2在RA滑膜细胞中表达显著升高.结论 正常人及类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞表达蛋白质组存在差异.这些差异蛋白可能参与类风湿关节炎的发病.     

平肝潜阳药物对甲亢肝阳上亢证大鼠下丘脑蛋白质表达的影响

目的:观察平肝潜阳药物对甲亢肝阳上亢证大鼠下丘脑蛋白质表达的影响,为进一步探讨平肝潜阳药物治疗甲亢肝阳上亢证作用机制提供依据.方法:左旋甲状腺素(L-T4)腹腔注射和附子汤灌胃以建立甲亢肝阳上亢证模型,应用蛋白质组学技术比较正常组、甲亢肝阳上亢证组及平肝潜阳药物治疗组中下丘脑的差异蛋白质.结果:3组蛋白质斑点总体分布相似,主要分布在等电点pI 3～10,分子质量为13.8～98.8 kD.与正常组比较,甲亢肝阳上亢证模型组中蛋白质点表达上调的有6个点,下调的有10个点;在模型组中上调的6个点在治疗后均较治疗前有下降;而模型组中下调的10个点在治疗后均较治疗前有上调.结合生物信息学进行质谱鉴定,发现其中9个蛋白质分别为prohibitin,硫氧还蛋白过氧化物酶6,组氨酸三聚体核苷结合蛋白1,蛋白酪氨酸磷酸酶,假定蛋白,肌动蛋白抑制蛋白2,硫氧还蛋白过氧化物酶-Ⅱ,热休克蛋白-27,膜联蛋白-A1.结论:平肝潜阳药物治疗后的甲亢肝阳上亢证大鼠下丘脑蛋白质的表达具有差异,所鉴定的这9个蛋白质可能与平肝潜阳药物的作用机制有关.