甲基化芯片筛选结核感染相关基因及后续验证

目的 筛选活动性结核患者DNA甲基化水平显著变化的基因并进行验证。 方法 ①纳入年龄与性别匹配的9例活动性结核患者、3例潜伏性结核患者和3例健康对照,将人血中单个核细胞DNA与芯片杂交,比较结核组与健康组的甲基化差异基因,并对差异基因进行GO功能和Pathway功能分析,以及与表达芯片进行联合分析;②收集年龄与性别匹配的活动性结核与健康对照各60例,分别提取全血DNA,使用焦磷酸测序方法对甲基化芯片预测出的结核病相关基因（TLR1、TLR2、TLR4）进行甲基化程度检测。 结果 ①活动性结核患者与健康对照对比,大部分呈现甲基化下调状态,GO分析和Pathway分析结果显示,甲基化差异基因的功能主要富集在白细胞分化、凋亡、自噬、细胞因子调节及炎症反应等与结核密切相关的生物过程中;②待验证的3个基因TLR1、TLR2、TLR4包含10个CpG位点,其中TLR1基因的CpG1位点（P<0.001）呈现高甲基化状态,TLR4基因的CpG2位点（P=0.012）呈现低甲基化状态。 结论 在结核分枝杆菌感染过程中存在基因组DNA的甲基化状态改变,以低甲基化变化为主。其中TLR1基因呈现高甲基化状态,TLR4呈现低甲基化状态,提示上述基因可能在结核病的发生发展过程中具有一定的作用。     

SFRP5在白血病细胞中基因甲基化状态及蛋白表达分析

目的检测白血病患者标本及细胞系中分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)基因启动子区域的甲基化状态及蛋白表达情况。方法甲基化特异性PCR(MSP)检测白血病患者及细胞系中SFRP5基因启动子区甲基化状态,亚硫酸盐测序PCR(BSP)方法检测KG1a细胞中SFRP5基因甲基化状态,Western blot方法检测SFRP5蛋白在白血病患者及细胞系中的表达。结果 12例白血病患者标本中有7例发生了SFRP5基因甲基化,6例正常对照标本均未发生SFRP5基因甲基化。4种白血病细胞系(HL-60、Raji、U937、KG1a)中均发生SFRP5基因甲基化。KG1a细胞中SFRP5基因启动子区-394 bp到+99 bp位点的CpG总甲基化频率为82.5%。白血病患者标本中有7例存在SFRP5蛋白表达,6例正常标本存在SFRP5蛋白表达,4种白血病细胞系中未检测到SFRP5蛋白表达。使用去甲基化试剂DAC处理4种白血病细胞系,结果均恢复SFRP5蛋白表达。结论白血病细胞中存在SFRP5基因启动子区甲基化,并导致SFRP5蛋白表达缺失或下调。     

The significance of mRNA expression and methylation of SFRP1 promoter in invasive breast cancer

目的 探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义.方法 采用实时荧光定量PCR技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测58例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中SFRP1基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系.结果 浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);腋窝淋巴结有转移的浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于腋窝淋巴结无转移组(P<0.05),而与其他临床病理参数无关.SFRP1在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在23例SFRP1基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到SFRP1的mRNA表达.结论 SFRP1基因异常甲基化可能影响其 mRNA的转录水平;SFRP1基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助.     

DKK3基因甲基化与乳腺癌的相关性研究

目的：检测乳腺浸润性导管癌（Invasiv ductal carcinom a,IDC）和普通型导管增生（Usual ductal hyperp lasi-a,UDH）病变中DKK3基因甲基化状况,探讨其与乳腺癌发生发展的相关性。方法：运用MALD I-TOF MS检测50例IDC和20例UDH样本中DKK3基因甲基化状态。结果：DKK3基因各CpG位点平均甲基化率范围在IDC和UDH组中分别为8%~26%和10%~24%;各CpG位点甲基化率在IDC和UDH病变中两两比较,差异无统计学意义。结论：DKK3基因甲基化可能与乳腺癌的发生发展有一定的相关性。     

定量检测E-cadherin基因启动子区甲基化芯片的建立

目的：拟建立一种能够定量检测抑癌基因E-cadherin甲基化改变的基因芯片.方法：用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,并以此为模板进行PCR扩增.目的序列中未甲基化的CpG住点被翻转成TpG,而甲基化的CpG位点保持不变.设计5组探针构建一种检测E-cadherin基因启动子区17个CpG住点甲基化改变的芯片,每组探针包括一对非甲基化探针和甲基化探针,检测相邻的3或4个CpG位点.结果：绘制标准曲线显示,芯片上探针的可重复性和精确性很好,并定量检测了1例白血病样本的甲基化改变.结论：基因芯片能够作为一种定量检测基因多个CpG位点甲基化改变的有效工具,并用于肿瘤的研究.     

DKK3和SFRP2基因甲基化在肿瘤中的研究进展

DKK3和SFRP2基因是W nt信号传导通路中的抑癌基因,其启动子区CpG岛的甲基化与乳腺癌、肠癌、肺癌、肝癌等许多恶性肿瘤的发生、发展密切相关,在恶性肿瘤中甲基化或高甲基化,在癌旁组织或正常组织中无甲基化或低甲基化,并且甲基化导致其基因表达明显下调。     

散发性结直肠癌中hMLH1基因启动子区CpG岛MVPs图谱的绘制与分析

目的 绘制散发性结直肠癌患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化可变位点(methylation variable positions, MVPs)图谱,分析MVPs图谱与hMLH1蛋白表达的关系,寻找CpG岛中影响蛋白表达的关键CpG位点.方法 采用重亚硫酸盐测序方法检测患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态;采用免疫组化方法检测相应蛋白表达水平.结果 CpG岛1(CGI-Ⅰ)甲基化阳性率为20 %(6/30);CpG岛2(CGI-Ⅱ)甲基化阳性率为13.33 %(4/30).hMLH1蛋白表达阳性率为50 %(15/30).经χ2检验,CGI-Ⅰ甲基化与hMLH1蛋白表达缺失存在显著性差异(P＜0.05)、CGI-Ⅱ甲基化与hMLH1蛋白表达缺失无差异(P＞0.05).结论 CGI-Ⅰ甲基化可能导致hMLH1蛋白不表达,其中1～28 CpG位点为导致hMLH1蛋白表达缺失的关键区域.     

SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化状态在肝细胞癌预后评估的价值

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）1、长散在核元件（LINE）1基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌( 简称肝癌)临床病理参数的关系,及其在肝癌预后评估的意义。方法 收集105例肝癌患者血浆和50例对照健康人血浆DNA,使用甲基化特异性PCR（MSP）检测了SFRP1基因启动子区CpG岛高甲基化和LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化的情况;分析两种基因启动子甲基化和肝癌患者临床病理参数之间的关系;通过Kaplan-Meier曲线、对数秩检验及Cox多因素分析,分析SFRP1、LINE1基因甲基化状态与肝癌患者总生存率及无病生存率之间的关系。 结果 105例肝癌患者血浆中SFRP1基因启动子区CpG 岛高甲基化阳性率为59.05 % (62/105),LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化率为66.67%（70/105）,基因SFRP1高甲基化和LINE1低甲基化表达均阳性为43.81% (46/105),正常对照组中未发现有这两种基因甲基化;SFRP1高甲基化、LINE1低甲基化均与HBsAg是否阳性及甲胎蛋白（AFP）值相关(P<0.05);SFRP1、LINE1基因启动子区域的甲基化状态与总生存率及无病生存率有关：SFRP1高甲基化阴性+LINE1低甲基化阴性组患者预后最好,而SFRP1高甲基化阳性+LINE1低甲基化阳性组患者预后最差。结论 SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化与肝癌的发生、发展有一定联系,SFRP1和LINE1基因甲基化状态可以作为潜在可靠的分子标记物对患者预后进行预测。     

齐齐哈尔地区汉族人群钠离子通道1A基因DNA甲基化与家族性原发性高血压的关系研究

目的 探究齐齐哈尔地区汉族人群钠离子通道1A(SCNN1A)基因DNA甲基化与家族性原发性高血压的关系。方法 选取2020年10月—2022年1月在齐齐哈尔市居住≥3代且年龄> 18岁的汉族原发性高血压患者180例作为研究对象。根据高血压确诊时间将其分为初诊组（入组时新发高血压）和既往组（入组前已确诊高血压），每组90例。另选取该地区90例无高血压家族史的健康体检者作为对照组。收集并整理各组患者的临床基础资料，采用焦磷酸测序法检测SCNN1A基因DNA甲基化，比较各组患者的SCNN1A基因编码区CpG1～CpG6位点DNA甲基化，以多因素Logistic回归分析家族性原发性高血压的影响因素。结果 各组性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、LDL、TC及FBG比较，差异无统计学意义（P>0.05）。初诊组和既往组TG、UA高于对照组，HDL低于对照组（P <0.05）。各组SCNN1A基因编码区CpG3、CpG4、CpG5、CpG6位点甲基化比较，差异无统计学意义（P>0.05）。初诊组和既往组SCNN1A基因编码区CpG2位点甲基化低于对照组，既往组CpG1位点甲...     

浸润性乳腺癌SFRP1基因的表达及其启动子甲基化的意义

目的探讨浸润性乳腺癌及相应癌旁乳腺组织中分泌型卷曲相关蛋白1(the secreted frizzled-relat-ed protein 1,SFRP1)基因的表达及其启动子CpG岛的异常甲基化状态,并分析其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR技术及甲基化聚合酶链反应(MSP)技术检测58例浸润性乳腺癌组织和相应癌旁乳腺组织中SFRP1基因的mRNA表达及其启动子CpG岛的异常甲基化情况,并分析其与临床病理参数之间的关系。结果浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于癌旁乳腺组织组(P<0.05);腋窝淋巴结有转移的浸润性乳腺癌组SFRP1基因的甲基化显著高于腋窝淋巴结无转移组(P<0.05),而与其他临床病理参数无关。SFRP1在浸润性乳腺癌组的mRNA表达量与乳腺癌旁组比较,差异有统计学意义(P<0.05);在23例SFRP1基因启动子CpG岛发生异常甲基化的浸润性乳腺癌组,均未检测到SFRP1的mRNA表达。结论 SFRP1基因异常甲基化可能影响其mRNA的转录水平;SFRP1基因启动子的甲基化与浸润性乳腺癌的发生发展有关,对其进行检测有可能为浸润性乳腺癌的早期诊断和判断预后提供帮助。     

胃癌患者SFRP1、SFRP2、SDC-2甲基化与病理特征的相关性分析

  目的  分析胃癌患者分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)、SFRP2及多能体蛋白聚糖-2(SDC-2)基因甲基化与胃癌临床病理特征的相关性。  方法  收集浙江中医药大学附属二院在2017年5月—2019年4月收治的接受胃癌根治术的100例患者,检测胃癌组织中SFRP1、SFRP2及SDC-2基因甲基化状态;分析上述基因甲基化率在不同临床病理特征的胃癌组织中的差异。  结果  癌肿组织中SDC-2、SFRP1、SFRP2基因甲基化率、肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移及分化程度存在不同程度的差异(均P < 0.05);多因素logistic回归分析显示,SDC-2甲基化(OR=0.384)是影响癌肿大小的独立保护因素(P < 0.05);SFRP2甲基化(OR=5.991)是影响肿瘤浸润深度的独立危险因素,SDC-2甲基化(OR=0.171)是影响肿瘤浸润深度的独立保护因素(均P < 0.05);SFRP1甲基化(OR=4.614)是影响肿瘤淋巴结转移的独立危险因素,SDC-2甲基化(OR=0.345)是抑制肿瘤淋巴结转移的独立保护性因素(均P < 0.05);SFRP1甲基化(OR=11.667)、SFRP2甲基化(OR=23.333)是影响肿瘤分化程度的独立危险因素(均P < 0.05)。  结论  SFRP1、SFRP2及SDC-2基因甲基化状态与胃癌患者临床病理特征存在高度相关性,SFRP1、SFRP2基因的甲基化可能是促进肿瘤增长、迁移、低分化的相关因素。      

Combination analysis of hypermethylated SFRP1 and SFRP2 gene in fecal as a novel epigenetic biomarker panel for colorectal cancer screening

Objective:To investigate the feasibility of the combination of detecting hypermethylated secreted frizzled-related protein 1(SFRP1)and secreted frizzled-related protein 2(SFRP2)in feces as a panel of biomarkers for colorectal cancer(CRC)screening.Methods:Methylation-specific PCR(MSP)was performed to analyze methylation status of SFRP1 and SFRP2 in a blinded fashion in tumor tissues and in matched stool samples from 39 patients with primary CRC,34 patients with adenomas,17 patients with hyperplastic polyps and 20 endoscopically normal subjects as normal controls.Simultaneously we analyzed the correlation of hypermethylated SFRP1 and SFRP2 with the clinicopathological features of CRC.Results:Hypermethylated SFRP1 was detected in 92.3%,76.5%,47.1% of tissue samples and in 89.7%,64.7%,35.3% of matched fecal samples from CRC,adenoma and hyperplastic polyp,respectively.Hypermethylated SFRP2 was detected in 87.2%,67.6%,35.3% of tissue samples and in 82.1%,55.9%,29.4% of matched fecal samples from CRC,adenoma and hyperplastic polyp,respectively.Of these two genes,at least one hypermethylated was 94.9%,82.4%,52.9% in tissue samples and 92.3%,73.5%,47.1% in matched fecal samples from CRC,adenoma and hyperplastic polyp,respectively.In contrast,no hypermethylated SFRP1 and SFRP2 were detected in mucosa tissues of normal controls,only 2 cases of fecal samples was detected with hypermethylated SFRP1 and another 1 case was detected with hypermethylated SFRP2.Moreover,no significant associations were observed between hypermethylated SFRP1,SFRP2 and clinicopathological features of CRC.Conclusion:Hypermethylation of SFRP1 and SFRP2 in feces are novel epigenetic biomarkers of CRC and carried high potential for the remote detection of CRC as non-invasive screening method,and combined analysis of hypermethylated SFRP1 and SFRP2 in fecal could further increase the detection rate of CRC and premalignant lesions.     

粪便多基因联合检测在结直肠癌早期筛查中的应用

目的 研究联合检测粪便中sFRP2、Vimentin和HPP1基因甲基化状态在结直肠癌早期筛查中的应用。 方法 将杭州市第三人民医院2017年10月—2019年10月期间收治的结直肠癌患者60例为结直肠癌组,由腺瘤性息肉患者60例及正常健康人30例组成非结直肠癌组(90例),收集清晨粪便标本,提取粪便DNA,并进行亚硫酸氢盐修饰处理,采用甲基化特异性PCR检测sFRP2、Vimentin和HPP1基因甲基化状态,分析其与结直肠癌临床病理特征的关系,比较3个基因联合检测诊断敏感度及特异度。 结果 在结直肠癌患者中,检测sFRP2、Vimentin和HPP1单基因甲基化敏感度分别为46.7%、43.3%、53.3%,特异度分别为73.3%、75.6%、76.7%;联合组以3个基因中任1个基因甲基化表达阳性判为阳性,联合检测诊断结直肠癌的敏感度为83.3%,特异度为46.7%,敏感度均高于sFRP2、Vimentin和HPP1单基因甲基化检测。3个基因甲基化状态与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结转移及TNM分期均无关(均P>0.05)。 结论 在结直肠癌患者粪便DNA中sFRP2、Vimentin和HPP1基因异常甲基化发生率明显高于非结直肠癌患者,联合检测粪便多基因筛查结直肠癌优于单基因检测,在结直肠癌早期筛查应用中具有重要意义。      

急性髓系白血病分泌型卷曲相关蛋白5基因启动子区甲基化状态研究

目的研究急性髓系白血病(AML)中WNT信号传导通路拮抗基因分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)基因的甲基化状态。方法应用甲基化特异性PCR(MSP)法对99例AML患者的骨髓或外周血进行SFRP5基因启动子区甲基化状况检测,并以70例门诊普通病人的外周血作为对照。结果 99例AML患者中检出10例(10.1%)SFRP5的甲基化,70例正常对照中仅检出1例(1.4%)SFRP5的甲基化。SFRP5在AML患者中的甲基化率显著高于正常对照(P<0.05)。SFRP5基因的甲基化状态与年龄、性别无关(P>0.05),与AML的临床分型相关(P<0.05)。结论 SFRP5基因的甲基化与AML有相关性,SFRP5基因的甲基化可能是引起AML的分子机制之一。     

启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化与基因节律性表达的关系

目的探讨mPer2、mCry1和mDBP启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化是否影响E-box和BMAL1/CLOCK基因和蛋白相互作用的方式;以及启动子区的甲基化状态是否影响MAP激酶磷酸化酶1(MAP kinase phosphatise 1,MKP1)的组织特异性表达调控。方法分6个时间点取C57 BL/6J小鼠的肝脏和肾脏,提取DNA,通过重硫酸盐处理基因组DNA,以及测序检测E-box和周围CpG岛的甲基化状态。结果 mPer2、mCry1和mDBP启动子区E-box以及周围CpG岛无明显甲基化状态,肝脏和肾脏中MKP1的E-box以及周围CpG岛亦无明显甲基化状态。结论节律基因的启动子区E-box以及周围CpG岛的甲基化不参与节律基因表达的日节律性调控。     

巢式甲基化特异性PCR检测不同类型组织标本中WIF-1基因启动子异常甲基化

目的:采用一种高灵敏度的DNA甲基化分析方法,即巢式甲基化特异性PCR法(nested-MSP,nMSP),检测外科手术切除新鲜组织、石蜡包埋组织及纤维支气管镜活检组织中WIF-1基因启动子的异常甲基化状态。方法:将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果:在3种类型的原发性非小细胞肺癌标本中都检测出了WIF-1基因启动子的异常甲基化。结论:巢式甲基化特异性PCR是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化的分析。