胞内氯离子通道蛋白在单增李斯特菌感染的炎性小体活化中的作用

目的探究胞内氯离子通道蛋白(CLICs)在单增李斯特菌(L.monocytogenes)感染的巨噬细胞炎性小体活化中的作用。方法原代培养小鼠来源的骨髓巨噬细胞,加入CLICs抑制剂IAA94用以抑制CLICs活性,感染L.monocytogenes,并分别通过ELISA、Western blot方法检测细胞培养上清液、细胞裂解液中白细胞介素-1β(IL-1β)的含量,研究CLICs对感染细胞炎性小体的活化作用。结果 ELISA实验显示IAA94处理的巨噬细胞在L.monocytogenes感染后释放的IL-1和乳酸脱氢酶(LDH)浓度下降;Western blot结果显示IAA94对L.monocytogenes感染引起的NOD样受体蛋白3(NLRP3)表达无影响。结论 CLICs促进L.monocytogenes感染的炎性小体的活化,但可能不通过NLRP3炎性小体通路,具体机制有待进一步研究。     

进口冷冻鸡翼尖中单增李斯特菌的分离与鉴定

目的单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌,严重威胁着畜禽和人类健康。近年来,已在世界许多港口产品(尤其冷冻食品)中被检测到,各国政府对此菌检测均十分严格。本实验在对一批从某国进口的鸡翅尖检测时,通过增菌与培养、miniVIDAS仪器初步筛选、科玛嘉李斯特显色培养基分离、API Listeria试验结果等最终鉴定为单增李斯特菌。     

单增李斯特菌的食源性污染状况及检测方法

单增李斯特菌是20世纪四大食源性污染的病原菌之一,也是中国21世纪对人类健康影响重大的12种病原菌之一。加强对食物中该菌检验检疫是关系到人类健康的头等大事。综述不同地域和年份不同种类食品中单增李斯特菌的分布情况,并简要介绍检测方法。     

快速检测单核细胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

目的:建立一种检测单核细胞增生李斯特菌核酸的快速、特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)方法。方法:针对单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素hlyA基因设计4条LAMP引物,在水浴箱内65℃保温约60 min,完成对单核细胞增生李斯特菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green I染色和电泳鉴定。利用LAMP和PCR方法同时检测1株单核细胞增生李斯特菌和10株非单核细胞增生李斯特菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性。用LAMP和PCR方法分别检测一系列稀释后的单核细胞增生李斯特菌菌液,比较两者的敏感性。结果:经肉眼、加染料和电泳均能观察到1株单核细胞增生李斯特菌LAMP扩增阳性反应,10株非单核细胞增生李斯特菌没有出现LAMP扩增。LAMP敏感度比PCR高,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌的检测下限为3 cfu/ml,PCR检测下限>300 cfu/ml。LAMP检测速度比PCR更快,只需要60 min。结论:建立了一种检测单核细胞增生李斯特菌的快速、特异的LAMP方法。     

树突状细胞在抗胞内菌免疫中的作用研究进展

树突状细胞（dendritic cell,DC）是一类具有树枝状突起,分布广泛且能表达MHC-Ⅱ类或MHC-Ⅰ分子的抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）,具有较强的刺激初始T细胞增殖的能力,在启动机体免疫反应并决定机体免疫应答方向中至关重要。正常情况下,体内绝大多数DC处于非成熟状态,其细胞表面B7家族分子（CD80／86）不存在,通过巨胞饮、受体介导的内吞及吞噬三种方式可以摄取外来抗原,从而获得促进其成熟的信号。     

食品中单核细胞增生李斯特菌分离及药敏试验的研究

目的：了解食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)的污染状况及药敏情况。方法:菌株分离鉴定应用国家卫生标准检验方法、API法和多聚酶链反应(PCR)；药敏试验采用Kirby—Bauer法。结果:李斯特氏菌(李氏菌)总污染率为5．18％(16／309)，其中生肉和水产品均为8％、熟肉制品为11．51％、生牛奶为3．51％、乳制品和蔬菜均未检出，Lm检出率为1．29％(4／309)，经PCR测定4株Lm同时含有内化素基因和李氏溶血素O基因，并且溶血试验与小鼠致病力试验均为阳性。药敏试验选用12种抗生素，4株Lm对庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、红霉素、氯霉素、四环素、头孢噻吩、头孢唑啉敏感；对依诺沙星和呋喃妥因耐药。结论:李氏菌在多种食品中均有不同程度的污染，4株Lm小鼠致病力阳性；溶血试验和PCR测定的溶血素基因是鉴别Lm的一个重要方法，Lm对多种抗生素敏感，对依诺沙星和呋喃妥因耐药。     

胞内菌与宿主自噬的相互作用

]自噬是一种进化保守的分解代谢过程,通过清除受损的细胞器和错误折叠的蛋白质,以维持细胞稳态。病原体感染触发的自噬可特异性地抑制机体内细菌的复制,从而保护细胞免受伤害。然而,许多病原微生物已进化出一系列对抗自噬的机制。本文综述聚焦胞内菌和宿主细胞之间的相互作用,简要概述胞内菌如何被自噬靶向清除,以及胞内菌如何调控自噬以促进其在细胞内的生存与繁殖。     

绵羊李斯特菌为载体的结核多阶段T细胞表位疫苗的构建及评价

  目的  构建以绵羊李斯特菌（Listerria ivanovii,LI）为载体的表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）特征性抗原蛋白的疫苗候选菌株,并评价其生物安全性和免疫效果。  方法  将MTB早期感染、潜伏感染和复发阶段的4种抗原基因的细胞表位串联形成融合抗原基因,即多阶段结核杆菌抗原基因,命名为msv。将msv插入含有LI同源序列的打靶质粒,利用同源重组技术构建基因组整合msv抗原基因的重组LI菌株。观察重组菌株的体外生长情况,通过Western blot验证靶抗原蛋白的表达情况,测定重组菌株对C57BL/6小鼠的半数致死量（50% lethal dose,LD₅₀）,以0.1×LD₅₀为免疫剂量,通过尾静脉接种小鼠,通过接种前及接种后1、2、3、5、7、14 d的血清谷丙转氨酶（ALT）水平、脏器载菌量和脏器病理切片评价疫苗候选株的安全性。为测定疫苗候选株的免疫效果,另取3组小鼠分别尾静脉免疫LI-msv、LI、NS,免疫后第9天制备脾悬液,流式细胞术检测分泌干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞水平。  结果  成功构建能表达多阶段结核杆菌抗原的疫苗候选株LI-msv。LI-msv 对C57BL/6小鼠的LD₅₀为3.3×108 CFU/只。通过尾静脉接种小鼠后,LI-msv主要在小鼠肝脏和脾脏内短期繁殖,7 d后能被机体清除,对肝、脾的病理损伤时间短且可恢复;流式细胞术检测结果表明接种LI-msv的小鼠脾淋巴细胞分化出了特异的IFN-γ+ CD4+ T细胞和IFN-γ+ CD8+ T细胞,阳性细胞比率较相应载体对照组和生理盐水对照组高（P<0.005）;特异性TNF-α+ CD4+ T细胞比率高于相应载体对照组（P<0.01）和生理盐水对照组（P<0.005）,TNF-α+ CD8+ T细胞比率高于生理盐水对照组（P<0.005）。  结论  成功构建了一株以LI为载体的表达结核杆菌多阶段抗原的疫苗候选株。该菌株具有生物安全性,且能诱导一定的特异性细胞免疫应答,有望作为结核疫苗候选株进行深入研究。     

医院内铜绿假单胞菌感染的临床分布及耐药性变迁

目的 了解医院内感染铜绿假单胞菌的临床分布及耐药性变迁情况,为临床治疗铜绿假单胞菌院内感染提供参考依据.方法 回顾性分析广东省中医院所属四家医院2006-2010年间住院患者分离铜绿假单胞菌病区分布、不同来源菌株药敏结果、连续5年耐药性变化及耐药组合分析情况.结果 5年间铜绿假单胞菌分离率最高的科室分别为重症监护室、呼吸内科和脑外科.痰标本检出铜绿假单胞菌最多,占83.7%,且痰标本分离铜绿假单胞菌比其他标本分离菌株更耐药.药敏结果显示氨曲南、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星耐药率呈逐年下降的趋势.耐药组合分析发现所分离铜绿假单胞菌对3种以上抗生素耐药的多重耐药菌占35.0%,对所分析抗生素全部耐药的菌株占总数的8.4%.结论 医院内获得铜绿假单胞菌感染以下呼吸道感染为主,且耐药性明显高于其他部位分离菌株.铜绿假单胞菌多重耐药菌株检出比例较高,耐药机制复杂,临床应根据其分布特点和药敏结果合理用药.     

卡介苗胞壁蛋白增强肺抗铜绿假单胞菌感染防御功能的研究

目的 观察卡介苗胞壁蛋白组分能否提高大鼠肺组织对铜绿假单胞菌的清除率.方法 密度梯度离心和分子筛方法分离卡介苗胞壁蛋白组分.用Northern 杂交和RT-PCR检测卡介苗全菌体及其胞壁蛋白组分对肺上皮SPC-A-1细胞β防御素hBD-1 mRNA表达的刺激作用;腹腔注射卡介苗胞壁蛋白组分48 h后,经气管滴入铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌,24 h后处死大鼠,取肺组织进行菌落计数.结果 卡介苗胞壁蛋白经分子筛层析后主要得到两大组分,Tricine-SDS-PAGE鉴定组分2相对分子质量约为18×103～30×103.Northern杂交显示热灭活卡介苗能提高肺上皮细胞β防御素hBD-1 mRNA表达,RT-PCR显示胞壁蛋白组分2刺激作用明显强于全菌体.经胞壁蛋白组分2治疗的大鼠肺组织铜绿假单胞菌数低于阴性对照组(P＜0.01),而对金黄色葡萄球菌感染无明显抵抗作用.结论 卡介苗胞壁蛋白组分可提高肺组织对铜绿假单胞菌的清除率,增强肺抗感染防御能力.     

表达绿色荧光蛋白的重组绵羊李斯特菌的构建及荧光分析

目的 构建表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组绵羊李斯特菌,为绵羊李斯特菌的研究提供重要工具。方法 利用SOEing PCR的方法将单核细胞增生性李斯特菌溶血素的启动子（phly）与GFP基因融合,连接到pCW质粒上,构建重组原核表达质粒pCW-phly-GFP。将重组质粒电转化绵羊李斯特菌,利用荧光显微镜分析荧光表达情况。分别在含红霉素和不含红霉素的BHI肉汤中连续传代培养携带重组质粒的绵羊李斯特菌,通过提取质粒和观察荧光的方法研究重组质粒pCW-phly-GFP及GFP在绵羊李斯特菌中的稳定性。结果 重组质粒pCW-phly-GFP酶切验证和测序均正确。在荧光显微镜下可以见到携带重组质粒的绵羊李斯特菌发绿色荧光。在红霉素抗性压力选择下重组质粒pCW-phly-GFP能稳定存在于绵羊李斯特菌中,并高效表达GFP。结论 成功构建了GFP基因原核表达质粒pCW-phly-GFP,能在绵羊李斯特菌中高效表达GFP,为进一步研究绵羊李斯特菌作为疫苗载体提供了重要的工具。     

绵羊李斯特菌载体结核疫苗株inlB1基因缺失减毒株的构建及评价

目的 对以绵羊李斯特菌（Listeriaivanovii,LI）为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性。方法 构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定减毒株LIΔinlB1-Ag85C和原始株LI-Ag85C的体外生长曲线;测定两株菌对于肝癌细胞系HepG2细胞的黏附、侵袭能力的影响,比较两株菌溶血能力的差异,两株菌对于小鼠的半数致死量（median lethal dose,LD50）差异。结果 敲除inlB1基因的重组结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C的基因序列符合预期结果。减毒株与原始株的体外生长情况基本一致;对于HepG2细胞的黏附率分别为6.66%和7.46%,侵袭率分别为0.031%和0.042%,减毒株的黏附、侵袭能力均低于原始株,但差异无统计学意义;减毒株的溶血活性较原始株无明显变化;对小鼠的LD50值分别为3.2×108 CFU/只和6.7×107 CFU/只,减毒株LD50相较于原始株明显提高。结论 成功构建inlB1基因缺失的新型结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C,其毒力较原始株降低。     

李斯特菌载体结核疫苗候选株基因重组构建及蛋白表达验证

目的 基因重组构建以单增李斯特菌、绵羊李斯特菌为载体的新型结核疫苗候选株,并进行蛋白表达验证,为结核疫苗研究和结核防控提供新思路和新方法。方法 以体外基因连接、质粒转化等技术,将本实验室已有的分别编码结核抗原Ag85C、ESAT-6蛋白的两种基因盒,插入携带单增李斯特菌、绵羊李斯特菌同源序列的打靶质粒中。将打靶质粒电转化单增李斯特菌、绵羊李斯特菌,在42 ℃和30 ℃连续传代,利用同源重组杂交原理和基因打靶技术,将打靶质粒携带的两种编码结核抗原的抗原基因盒,分别整合至致病基因（actA和plcB）被敲除的单增李斯特菌、绵羊李斯特菌减毒株及未经减毒的绵羊李斯特菌基因组中。重组菌经蓝白斑、抗生素抗性及PCR筛选,再经Western blot检测其菌体蛋白及分泌蛋白的表达情况。结果 构建了携带抗原基因盒的重组菌株5株,其重组基因序列PCR验证结果均符合预期,且测序验证成功;重组菌不携带红霉素抗性基因,表型特征符合预期;其中,重组菌Li-Rv0129c、Li-ΔactAplcB-Rv0129c按预期表达了结核杆菌Ag85C抗原蛋白,Li-ΔactAplcB-Rv3875按预期表达了结核杆菌ESAT-6抗原蛋白,Lm重组菌未表达相应结核抗原蛋白。结论 成功构建并筛选得到3株以绵羊李斯特菌为载体的、携带结核杆菌Rv0129c（编码Ag85C）抗原基因盒或Rv3875（编码ESAT-6）抗原基因盒,且表达相应抗原蛋白的新型结核疫苗候选株。     

《黄帝内经》中“开鬼门、洁净府”理论的现代临床应用

“开鬼门、洁净府”理论最早记载于《素问·汤液醪醴论》,通过查阅文献并整理,明确其具体含义指宣肺发汗、通腑排浊与清利小便之法。文章拟对现代医家运用“开鬼门、洁净府”理论指导临床治疗心、肺、肾系疾病、肢节类疾病、皮肤类疾病的应用进行梳理,体现经典理论对于现代临床疾病的指导意义与价值。“开鬼门、洁净府”是中医治疗疾病的经典理论法则,合理应用将取得良好疗效,对中医经典理论传承具有重要意义,值得中医学者进一步研究及探讨。     

杭白菊、当归、丹参提取液抑制黄褐斑形成及机制研究

目的 观察杭白菊、当归、丹参提取液对im黄体酮及紫外（UV）照射导致的黄褐斑小鼠模型的抗氧化与抗黄褐斑形成作用。方法 将小鼠随机分成对照组、模型组、维生素C组、杭白菊组、当归组、丹参组共6组。采用im黄体酮及辅助UV照射方法建立黄褐斑小鼠模型。测定各组肝脏及皮肤组织中的谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、酪氨酸酶（TYR）活性与总抗氧化能力（T-AOC）,以及丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、肝脏脂褐质水平,并测定血液流变学指标,进行皮肤病理学检查。结果 杭白菊、当归、丹参提取液显著增强黄褐斑小鼠肝脏和皮肤中GSH-Px、SOD活性,降低MDA水平,抑制TYR增加,使黑素细胞（MC）生成减少,抑制黑色素合成,从而减轻皮肤色素沉着。结论 杭白菊、当归、丹参提取液有一定的防治黄褐斑的功效,其作用与提高机体抗氧化能力,抑制TYR活性,减少黑色素的合成以及改善机体的血液流变学有关。     

UPLC-ELSD法同时测定重楼中重楼皂苷I、II、VI、VII

目的 建立同时测定重楼中重楼皂苷I、II、VI、VII的超高效液相色谱-蒸发光散射（UPLC-ELSD）分析方法。方法 采用Waters Acquity UPLC H-Class色谱系统,ELSD检测器,BEH C¹⁸色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）,流动相为乙腈-水,以体积流量0.45 mL/min进行梯度洗脱,柱温30 ℃。结果 被测成分在线性范围内均具有良好的线性关系（r＞0.999 5）;平均回收率在98.36%～100.11%,RSD≤1.56%。结论 UPLC法分离效果及重现性好,且快速、简便,可作为重楼的质量控制方法。     

转双价抗虫基因 Bt-CpTI 提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性

目的 将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因 CryIA(c) 和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 CpTI 共同转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性。方法 构建了以 CaMV 35S 为启动子,新霉素磷酸转移酶 (Npt-Ⅱ) 为选择标记,带有 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因的植物表达载体 pGBI121S4ABC 并转入根癌农杆菌 LBA4404。采用叶盘法遗传转化四倍体菘蓝。转基因再生植株经 PCR 和 Southern 杂交检测,并进行抗小菜蛾实验。结果 T₀ 代转化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到 16.67%。Southern 杂交检测结果表明外源 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中。与野生对照相比,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性。结论 转双价抗虫基因 Bt-CpTI 是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段。     

5种马鞭草科药用植物的抗补体活性

采用细胞溶血法考察了千解草(Pygmaeopremna herbacea)、白花灯笼(Clerodendrum fortunatum L.)、尖尾枫[Callicarpa longissima(Hemsl.)Merr.]、赪桐[Clerodendrum japonicum(Thunb.)Sweet]及臭茉莉(Clerodendrum philippinum Schauer var.simplex Moldenke)等5种马鞭草科药用植物提取物经典途径和旁路途径的抗补体活性。结果表明:千解草水提取物、白花灯笼水提取物和醇提取物、尖尾枫水提取物和醇提取物、赪桐醇提取物及臭茉莉醇提取物有较强的经典途径抗补体活性,对经典途径的抗补体活性(CH50)分别为0.092±0.008,0.074±0.008,0.088±0.006,0.134±0.017,0.123±0.010,0.380±0.080及0.200±0.015 g/L;仅千解草和尖尾枫水提取物及白花灯笼醇提取物具有旁路途径抗补体活性,对旁路途径的抗补体活性(AP50)分别为0.533±0.033,0.758±0.031和0.362±0.029 g/L。因此,5种植物均具有不同程度的抗补体活性,其中白花灯笼醇提取物抗补体活性最强。     

P-选择素缺失对小鼠生理特征的影响

目的 探讨P-选择素基因（P-selectin）缺失对小鼠生理特征的影响。方法 P-选择素敲除（PKO）小鼠和C57小鼠饲养于SPF级环境中,通过基因鉴定确定其为纯和PKO小鼠。观察PKO小鼠的活动状态、繁育状况,检测血常规,确定P-选择素敲除后对小鼠一般情况的影响。分别于6周和18周处死小鼠,通过伊红&苏木素（HE）染色,观察P-选择素敲除后对小鼠各个脏器组织结构的影响。结果 PKO小鼠与正常C57小鼠的繁育状况相似,血常规无异常,HE染色发现PKO小鼠肝、脾、肺、肾组织结构均较正常。结论 P-选择素的缺失不会对小鼠生殖繁育、血液造成影响,对重要的组织脏器也未见明显影响,为以后进一步研究P-选择素在疾病中的作用提供了动物模型研究理论基础。     

《脾胃论》之五运六气理论浅析

《脾胃论》是李东垣的代表作之一,其内容除了体现脾胃中心理论外,还蕴含了丰富的运气理论,目前尚未被完全解读。文章从李东垣的时代背景、甲己化土理论、擅用升阳风药、因时用药等方面具体阐述五运六气理论在《脾胃论》中的体现与临床应用。