网织红细胞与骨髓瘤细胞杂交的胞质杂交体细胞血红蛋白的PAGE电泳分析

小鼠网织红细胞(RM)×人早幼粒白血病细胞突变株(Hb-60-AR);兔网织红细胞(RR)×小鼠BW-胸腺淋巴肉瘤细胞(BW5147);大鼠骨髓有核红细胞(RNR)×小鼠SP2/0浆细胞瘤细胞等不同异种杂交组合的胞质体杂交细胞珠蛋白基因产物血红蛋白的PAGE电泳分析,结果表明在正常状态下检测不到血红蛋白的肿瘤细胞,一旦与网织红细胞或有核红细胞融合后,则能持续地出现血红蛋白,进一步证明哺乳类红细胞胞质因子具有调节基因活动,激活珠蛋白基因表达的作用,不同种属红细胞胞质因子似无种属特异性。     

网织红细胞胞质因子调控肿瘤细胞基因表达的核酸杂交分析 Ⅱ.myc癌基因的表达状态

本实验用Northern杂交方法,以c-myc癌基因为探针,对人和小鼠骨髓瘤细胞以及杂交后的同种和异种胞质体杂交细胞和异种杂交细胞进行了癌基因表达的核酸分子杂交分析。结果表明,在小鼠-小鼠,小鼠-兔及人-小鼠的胞质体杂交细胞(BW-RM,BW-RR,HMy-RM)中均未检测到myc癌基因的表达产物。但自15代以后开始出现微弱或可测的表达活性,并随传代而有上升的趋向。同样,在小鼠浆细胞瘤(Sp2/o)与大鼠有核红细胞(ER)的异种杂交中,杂交细胞(SpER)的第4代和第7代细胞中亦未检查到myc基因转录物。表明细胞杂交后,myc基因受到了抑制。这种抑制作用似无种属特异性。这一结果提示红系细胞内“胞质因子”对肿瘤细胞原来活化的myc基因具有抑制作用,并与杂交细胞的恶性下降有关。论文对胞质因子对癌基因表达的调控作用及其分子生物学机理进行了讨论。     

兔网织红细胞胞质因子对小鼠骨髓瘤细胞恶性调控的研究

以无细胞核的兔网织红细胞与小鼠骨髓瘤细胞BW(胸腺淋巴肉瘤)及SP2/0(浆细胞瘤)分别进行异种杂交。实验结果表明杂交后形成的二种胞质杂交细胞(BW-RR及SP 2/0-RR)均呈现下列去恶性分化特征;①细胞分裂指数、~3H-TdR标记指数及生长曲线明显下降。其中SP2/0-RR的核分裂活动受到明显的抑制;②在软琼脂培养中不形成集落;③异种移植至裸鼠不长瘤;④染色体数量减少,众数及畸变率下降;⑤出现正常分化的珠蛋白基因产物血红蛋白和HGPRT基因的酶产物,珠蛋白探针分子杂交实验证明有珠蛋白基因的表达。为不同种属红细胞胞质因子调控肿瘤细胞恶性提供了证据。论文对胞质因子调控基因表达、恶性逆转及其在红细胞发生过程中自然去核的物质基础等问题进行了讨论。     

网织红细胞与骨髓瘤缺陷株细胞杂交前后HGPRT酶基因产物的测定

本研究建立了HGPRT酶的测定方法,对自然去核的哺乳类网织红细胞与小鼠骨髓瘤及人肿瘤突变型细胞杂交前后的HGPRT基因产物进行测定结果表明:①自然去核后的兔和小鼠网织红细胞质中含有高活性的HGPRT酶,其活性浓度与有细胞核的人早幼粒白血病细胞HL-60及人胃癌823细胞相当;②无核和缺失HGPRT酶基因定位的X染色体的上述网织红细胞分别与HGPRT阴性的小鼠骨髓瘤Bw及人早幼粒白血病的HL-AR突变株细胞杂交后,获得HGPRT阳性的胞质体杂交细胞。这些杂交细胞及其子代均出现中等阳性的HGPRT酶活性。提示用无细胞核而含基因产物的胞质体可能激活或诱导宿主细胞相应基因进行表达。     

胞质因子对肿瘤细胞恶性的调控研究——小鼠骨髓瘤细胞与网织红细胞胞质体的胞质杂交实验

本文选用无细胞核而富含珠蛋自mRNA的正常小鼠网织红细胞与骨髓瘤细胞系中的BW胸腺淋巴肉瘤细胞系、NS-1浆细胞癌细胞系及P388淋巴瘤细胞等分别进行胞质杂交实验,以研究胞质因子调控肿瘤细胞恶性的可能性。实验结果表明3种淋巴瘤细胞在并入网织红细胞胞体后所形成的杂交细胞呈现下列去恶性化特征:1)杂交细胞出现组织化学反应及超微结构形态改变;2)细胞分裂指数及生长速度明显下降;3)作异种移植至裸鼠后丧失发生肿瘤能     

人浆细胞瘤与小鼠网织红细胞异种杂交的恶性调控研究

用人浆细胞瘤细胞与小鼠网织红细胞异种杂交获得成功。杂交细胞可以传代,出现下列明显的肿瘤细胞去恶性化特征:①生长速度及~H-TdR并合率明显下降;②出现红细胞特异的遗传标记——血红蛋白;③出现慢型迁移率的葡萄糖-6-磷酸异构酶Gpi;④在软琼脂培养基中不形成细胞集落;⑤异种移植至裸鼠后丧失发生肿瘤的能力。表明红细胞胞质体杂交模型可以用作研究细胞恶性调控的实验系统。对调控肿瘤细胞恶性表型的可能机理进行了讨论。     

人白血病突变株红细胞胞质杂交体的建立及在恶性调控研究中的应用

细胞分化、基因表达和恶性表型的调控是当代细胞与分子生物学领域中的重大研究课题。近几年来中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学室利用天然无核的小鼠或兔的网织红细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(BW-5147,NS-1,Sp2/0和p388)或人骨髓瘤细胞系(HL-60-AR,HMY)融合,建立了7株可传代和可逆转恶性表型的红细胞胞质杂交模型,以及1个以大鼠成红细胞与小鼠Sp2/0细胞融合的杂交瘤。这些胞质杂交体,包括遗传型相同的小鼠-小鼠同种间的胞质杂交系(BW-R,     

网织红细胞作为转基因靶细胞的实验性研究

采用无核兔网织红细胞作为外源基因导入的靶细胞，以β－半乳糖苷酶基因的真核表面质粒作为报告基因，研究网织红细胞作为外源基因表达宿主的可能性。结果表明，β－半乳糖苷酶基因可以在兔网织红细胞中有限表达。     

人肺巨细胞癌突变株HDM5和小鼠网织红细胞融合后珠蛋白基因表达的研究(简报)

为证实哺乳类红细胞调节因子对珠蛋白基因的调控作用,用人肺巨细胞癌突变株HDM5和小鼠网织红细胞进行细胞融合。亲代肿瘤细胞株HDM5是由人肺巨细胞癌细胞株PLA801—D95经N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变,8-杂氮乌嘌呤(8-AG)筛选而获得的次黄嘌呤乌嘌呤磷酸核糖转移酶缺失(HGPRT~-)的突变株。亲代正常细胞网织红细胞由盐酸苯肼制造的昆明种小鼠获得。两者用聚乙二醇(PEG1000)促融,融和细胞经HAT培养基选择后获得数个杂种细胞克隆,定名为HDM5-MR     

人β-珠蛋白小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达及开关机制研究

目的从RNA角度研究珠蛋白基因表达调控,探讨人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的分子机制,为β-珠蛋白生成障碍性贫血的分子治疗提供新靶位,并为诱导肿瘤细胞分化治疗肿瘤提供依据。方法通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)比较白血病和非白血病患者外周血白细胞血红蛋白基因分子水平的差异,将β-珠蛋白基因转染K562细胞,运用噻唑蓝比色法、细胞流式分选等技术检测β-珠蛋白基因对K562细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响,通过Western blot及RT-PCR分别从蛋白质水平和mRNA水平分析其调控γ-珠蛋白基因表达的作用,同时运用生物信息学预测人β-珠蛋白基因可以产生具有基因表达调控作用的小分子RNAs。结果白血病患者血红蛋白A1、血红蛋白B、血红蛋白E1、细胞珠蛋白、脑红蛋白的mRNA表达均显著低于非白血病患者(P<0.05)。β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,并在第7天达到最佳时间效应。用RT-PCR检测转染后K562细胞α、β、γ-珠蛋白等mRNA的表达,发现β-mRNA上升导致转染后的K562细胞γ-珠蛋白表达下调,同时α-珠蛋白表达上调;β-珠蛋白基因可能产生作用于γ-珠蛋白的小分子RNA,符合条件的二级结构在热力学上稳定,空间位阻也在一定范围内。结论白血病患者外周血白细胞珠蛋白基因低表达,β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,其高表达可诱导K562细胞增殖受抑和凋亡,并抑制K562细胞γ基因表达,通过小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达沉默,有助于揭示人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的基因表达调控及开关机制。