Caspase-3融合蛋白基因的构建及其对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的：观察重构型caspase-3及其N-端融合蛋白的表达对HeLa细胞的凋亡诱导作用。方法：用反转录PCR获取人caspase-3基因,用重组PCR方法构建人重构型caspase-3及其融合蛋白基因,将基因克隆入表达载体pcDNA3,脂质体法转染HeLa细胞,通过细胞计数、电镜观察、MTT法等检测被转染细胞的生长及其凋亡状况。结果：成功获得了caspase-3基因,构建了重构型caspase-3基因和重构型caspase-3与绿脓杆菌外毒素（PE）转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因及其表达载体,与对照组相比,在转染后1-4d内,两种基因的表达均导致HeLa细胞存活数减少,大量细胞发生凋亡,且二活性相当。结论：重构型caspase-3及其融合蛋白可以诱导转染的HeLa细胞发生凋亡。     

人截短型凋亡诱导因子AIF△1-480的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的: 观察人截短型AIF(AIF△1-480)基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法: 在人截短型AIF(AIF△1-120)基因克隆成功的基础上,进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1-480位氨基酸)编码序列的人截短型AIF(AIF△1-480)基因.将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察、电镜观察等方法,检测目的基因在转染细胞中的表达以及对转染细胞形态的影响.结果: 成功构建了人截短型AIF(AIF△1-480)基因的真核表达载体.转染细胞后,可检测到人截短型AIF(AIF△1-480)分子的表达.转染后48 h,可观察到表达人截短型AIF(AIF△1-480)分子的细胞呈现典型的凋亡特征.结论: 人截短型AIF(AIF△1-480)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡.     

人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用

目的:观察人截短型凋亡诱导因子(AIF△1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用.方法:在AIF△1-120基因克隆成功的基础上进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号,FAD结合结构域和NADH结合结构域(1-400位氨基酸)编码序列的AIF△1-400基因,将其克隆入pcDNA3和pIRES2-EGFP真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察,MTT检测等方法检测该基因在转染细胞中的表达及其对肿瘤细胞的促凋亡活性.结果:经酶切鉴定与测序证实,带有AIF△1-400的真核表达载体构建成功.瞬时转染后出现细胞形态变化,随转染时间的延长转染细胞数减少,荧光变弱.经间接免疫荧光检测可观察到截短型AIF蛋白位于细胞质中,部分已位于细胞核内.MTT法检测发现AIF△1-400转染后对细胞生长有明显的抑制作用.结论:AIF△1-400仍然具有诱导HeLa细胞凋亡的作用.     

HER2靶向重组截短型Bid片段融合蛋白对骨肉瘤细胞的促凋亡作用

目的：观察人上皮细胞生长因子受体2（HER2）靶向重组的活性截短型Bid（tBid）融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用。方法：将抗HER2单链抗体基因e23sFv、与绿脓杆菌外毒素（PE）的转膜结构域基因（PEII）和tbid基因连接，构建成immuno—tbid（e23 sFv—PEII-tbid）基因，将其克隆入真核表达载体pCMV中，转染SOSP-9607细胞，间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，通过AnnexinV染色、流式细胞仪检测观察其促凋亡作用。结果：转染SOSP-9607细胞后，间接免疫荧光染色检测出tBid的表达．SOSP-9607细胞出现明显的固缩，核浓缩等凋亡特征。AnnexinV染色、流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞，凋亡率为42％，对照组细胞仅6％，表明细胞膜表面有磷脂酰丝氨酸外翻，提示重组immuno—tbid基因表达后有促凋亡作用。结论：重组immuno—tbid基因可在转染的SOSP-9607细胞中表达，并诱导其细胞凋亡。     

人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达

目的 构建携带人granzyme B基因的真核表达载体，并将其在HeLa细胞中的表达。方法 用反转录PCR获取人granzyme B全长cDNA序列，将其活性型序列克隆进pcD-NA3重组表达质粒。脂质体法转染HeLa细胞，间接免疫荧光检测目的蛋白表达，HE染色观察其对转染HeLa细胞形态的影响。结果工成功获得了野生型granzyme B cDNA，构建了编码活性型granzyme B的真核表达载体pcDNA3-G。转染HeLa细胞后观察到目的的蛋白表达，转染细胞形态发生变化，出现多核大细胞及固缩小细胞。结论 活性型granzyme B哺乳动物表达系统的建立，为进一步研究granzyme B的生物学效应奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

全长和截短型Cx36基因重组载体的构建及在Hela细胞的表达

目的V构建全长及截短型Cx36基因重组表达载体,观察其在Hela细胞的表达。方法RTPCR获得全长及截短型Cx36编码区基因片段,与pCR2.1TOPO克隆载体连接酶切纯化鉴定,亚克隆到pcDNA3构建真核表达载体,脂质体介导法转染Hela细胞,G418抗性筛选阳性克隆,Western印迹和免疫荧光方法分析Hela细胞Cx36的表达。结果构建了全长及截短型重组真核表达载体Cx36-pcDNA3,转染的Hela细胞获得稳定表达Cx36的基因,Western印迹和免疫荧光显示转染的HeLa细胞表达Cx36蛋白,但转染截短型Cx36的Hela细胞表达量明显少于转染全长Cx36的细胞。结论全长及截短型Cx36基因可在Hela细胞中稳定表达,截短型Cx36基因表达较少。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6 基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用. 方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6. 将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞. MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用. 结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确. 转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达. MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征. 结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.     

重组抗HER2 ScFv/tbid基因的表达及其对乳腺癌SKBr-3细胞的促凋亡作用

目的:观察构建的重组抗HER2 ScFv /tbid基因在SKBr-3细胞中的表达及其对转染的SKBr-3细胞的作用. 方法:用限制性内切酶双酶切已构建的pcDNA-bid质粒,获得带有PE转膜结构域和tbid的重组基因,将所获基因插入到真核表达载体pCMV单链抗体基因ScFv23e的下游,转染SKBr-3细胞. 间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达,MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况. 结果:转染SKBr-3细胞后,检测出目的蛋白的表达. MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制. 间接免疫荧光双标记染色检测tBid的表达,并可观察到Cyt c在细胞质中存在, SKBr-3细胞出现凋亡. 结论:重组抗HER2 ScFv /tBid分子可以在转染的SKBr-3细胞中表达,并且可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡.     

抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的：实现二硫键稳定的抗肝癌单链抗体与PE38融合，免疫毒索在大肠杆菌中的可溶性表达，为下游的活性检测等工作打下基础．方法：设计了两种不同的表达载体(GST、硫氧还蛋白促可溶表达载体)，并通过改变宿主菌菌株、IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等，优化表达条件；通过ELISA法判断该免疫毒素中单链抗体的结合活性．结果：抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌Origami(DE3)的上清中得到表达，表达量占菌体总可溶蛋白量的21％：ELISA法证实该融合蛋白保持了亲本抗体的特异性．结论：dsFv-PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达为其他融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供了思路．     

不同变异位点的HIV-1 vpr重组真核表达载体对转染细胞凋亡作用的观察祆

目的 观察不同的人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的vpr基因变异株致宿主细胞凋亡作用的区别,及其可能的机制.方法 14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 vpr基因片断,其PCR产物纯化后经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,以pcDNA3.1(+)真核表达质粒连接转化实验,将重组质粒用脂质体瞬时转染至HeLa细胞,G418筛选后收获细胞.RT-PCR检测目的 基因mRNA水平的表达,荧光染色在显微镜下观察Hoeschst凋亡细胞并计算凋亡率,DNA琼脂糖电泳观察各转染细胞凋亡条带,膜联蛋白V-FITC流式细胞检测各株细胞凋亡率,并比较各株细胞的半胱酸蛋白水解酶3活性差别.结果 14个vpr基因片段转染HeLa细胞后,发现有第70、85、86或94位变异的vpr转染细胞Hoeschst染色凋亡率和半胱酸蛋白水解酶3活性检测(分别为0.1225,0.1675,0.1975,0.1575和11.356,8.021,14.6875,10.521)较无这些变异的保守序列vpr转染细胞(0.355和182.4875)为低,DNA琼脂糖电泳法和膜联蛋白细胞凋亡检测也提示同样的规律;第1～7号重组质粒(均为vprAE亚型)的致细胞凋亡能力也明显小于第8～14号重组质粒(vpr B,AB,C和C/BC亚型).结论 首次观察到有第70、85、86或94位变异的HIV-1 vpr序列,其致HeLa细胞凋亡的能力低于无这些位点变异的保守序列,AE亚型诱导宿主细胞凋亡能力低于其他亚型,其机制之一与半胱酸蛋白水解酶3途径激活降低有关.     

核转运抑制肽表达载体的构建及对HeLa细胞增殖、迁移的影响

目的 构建核转运抑制肽与红色荧光蛋白(RFP)的融合表达载体,探讨该融合蛋白在HeLa细胞中的表达、定位以及对细胞增殖、迁移的影响。方法 分别合成编码两种核转运抑制肽Bimax1和Bimax2的多核苷酸,退火后插入红色荧光蛋白表达载体pDs-Red-C1;质粒转化大肠杆菌DH-5α,挑取阳性菌进行DNA测序;利用脂质体转染法将重组载体pDs-Red-Bimax1、pDs-Red-Bimax2及空白载体转入HeLa细胞中,荧光显微镜观察红色荧光的表达与定位;MTT实验和细胞迁移实验检测融合蛋白表达对细胞增殖、迁移的影响。结果 DNA测序显示,两种核转运抑制肽Bimax1和Bimax2成功插入红色荧光蛋白表达载体;转染真核细胞后Bimax1和Bimax2引导红色荧光蛋白在细胞核表达;同时,融合蛋白RFP-Bimax1和RFP-Bimax2对HeLa细胞的增殖、迁移有抑制作用。结论 成功构建核转运特异性抑制肽与红色荧光蛋白融合表达的载体,融合蛋白在细胞核局限表达并能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移。     

顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和凋亡

目的：探讨顺铂对HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2蛋白表达及核转位的影响,并观察细胞自噬和凋亡的变化。方法：使用不同浓度的顺铂(0、2.5、5、10μmol/L)干预HeLa人宫颈癌细胞,MTT法检测细胞活性,Transwell实验观察细胞迁移能力,mCherry-GFP-LC3B融合蛋白腺病毒转染HeLa细胞观察自噬水平的变化,流式细胞术检测细胞凋亡水平,免疫蛋白印迹检测Nrf2在细胞质和细胞核内的表达情况,免疫荧光法观察Nrf2的核转位情况。结果：与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可抑制HeLa细胞的活性及细胞迁移能力(P<0.05),且随着药物浓度增高抑制作用增强(P<0.05)。与对照组相比,2.5、5、10μmol/L的顺铂均可促进HeLa细胞中LC3B的表达、细胞凋亡及Nrf2的核转位(P<0.05),降低细胞质中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05),并升高细胞核中Nrf2的蛋白表达水平(P<0.05)。结论：顺铂通过增加HeLa人宫颈癌细胞中Nrf2入核促进细胞自噬和细胞凋亡,并抑制细胞的活性和迁移能力。     

IKCa1基因shRNA真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建针对钙激活性中电导钾离子通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels,IKCa1)的小发夹RNA(small hair RNA,shRNA)真核表达载体,观察其在宫颈癌细胞HeLa中的表达。方法:设计、合成IKCa1基因特异性shRNA序列,插入空载体pGenesil-1.1中,构建重组体,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,半定量RT-PCR和Western blotting技术检测转染前后HeLa细胞中IKCa1的表达。结果:成功构建IKCa1 shRNA真核表达载体,转染后HeLa细胞中IKCa1的表达受到显著抑制。结论:成功构建IKCa1特异性shRNA表达载体,为进一步研究IKCa1参与宫颈癌发生发展的机制奠定实验基础。     

GFP-hDaxx融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的：构建GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP/hDAXX，并在HeLa细胞中表达，为进一步研究hDaxx在细胞凋亡、病毒感染中的作用提供实验基础。方法:用T4DNA连接酶将hDaxx亚克隆入载体pEGFP，筛选阳性克隆。将质粒pEGFP／hDaxx转染HeLa细胞，Western-Blotting鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的定位。结果：成功构建了GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP／hDaxx，GFP-hDaxx融合蛋白成功表达并定位HeLa细胞核。结论:GFP-hDaxx融合蛋白成功地在真核细胞表达并定位于细胞核。     

过表达TPX2对人宫颈癌HeLa细胞侵袭和凋亡的影响

目的 通过TPX2过表达慢病毒载体在人宫颈癌HeLa细胞过表达TPX2基因,在体外研究TPX2对人宫颈癌HeLa细胞侵袭和凋亡的作用及其相关机制.方法 构建TPX2过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)及阴性对照(LV11-NC),选取稳定感染过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)的HeLa细胞作为过表达组,将稳定感染(LV11-NC)的HeLa细胞作为阴性对照组,未感染病毒的人宫颈癌HeLa细胞作为空白对照组(CON).采用Transwell基底膜侵袭实验测定各组细胞的侵袭能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况,Western blot检测细胞凋亡及侵袭相关蛋白质Bcl-2、Bax、Caspase-3、MMP-9、基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)及nm23-H1的表达.结果 成功构建TPX2过表达慢病毒载体(LV 11-TPX2),可有效过表达TPX2 mRNA及蛋白质.与对照组比较,TPX2过表达组的HeLa细胞凋亡率明显减少(P＜0.05),穿过Transwell小室基底膜细胞明显增加(P＜0.01).LV11-TPX2感染组HeLa细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2的表达明显上调(P＜0.05),Caspase-3及Bax的表达明显下调(P＜0.05);侵袭相关蛋白质nm23-H1及TIMP-1水平明显下调(P＜0.05),MMP-9水平明显上调(P＜0.05).结论 在宫颈癌细胞过表达TPX2基因后,能抑制细胞凋亡,增强其侵袭能力,可能的机制为在宫颈癌细胞过表达TPX2能诱导凋亡和侵袭相关蛋白Caspase-3、Bax、nm23-H1及TIMP-1水平下调,Bcl-2及MMP-9水平上调.