中期保存的兔角膜内皮细胞的形态学观察

目的　通过对兔角膜内皮细胞形态结构的观察 ,了解中期保存对内皮细胞的影响。方法　前房内注入M K液 ,全眼球保存兔角膜。在保存 1、3、5、7d后 ,分别进行角膜内皮显微镜检查、角膜内皮细胞活性染色及电镜学检查。结果　随着保存时间的延长 ,角膜内皮细胞的活性不断降低。尤其在保存 7d后 ,角膜内皮细胞存活率及六边形细胞百分率明显下降。超微结构显示细胞膜连续性破坏 ,细胞器丢失 ,细胞死亡。结论　角膜中期保存液保存角膜的最佳时间为 1～ 5d。     

VitE对中期保存的兔角膜内皮细胞的影响

目的探讨Vitamin E对中期保存的兔角膜内皮细胞的保护作用及机制。方法前房内分别注入M-K液,以及含有25、50、100mol／L Vitamin E的M—K液,全眼球保存兔角膜。在保存1、3、5d后,分别进行角膜内皮细胞活性染色以及角膜内皮显微镜检查。结果保存后实验组内皮细胞存活率高于对照组。保存后各实验组的六边形细胞百分率、细胞平均密度均较对照组高。结论在角膜中期保存液中加入一定剂量的Vitamin E,能够提高内皮细胞的抗氧化能力,延长角膜的保存时间。     

硒对中期保存的兔角膜内皮细胞的影响

目的 探讨硒对中期保存的兔角膜内皮细胞的保护作用及机制。方法 前房内分别注入M-K液，以及含有3μmol／L、5μmol／L、8μmol／L亚硒酸钠的M-K液后。全眼球保存兔角膜。在保存1、3、5d后。分别行内皮细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力检测、角膜内皮细胞活性染色、角膜内皮显微镜检查。结果 保存后实验组GSH-Px活力明显高于对照组。保存3d及5d后实验组内皮细胞存活率高于对照组。内皮显微镜显示。保存后的六边形细胞百分率各实验组均较对照组高。保存5d后实验组细胞平均密度高于对照组。结论 在角膜中期保存液中加入一定剂量的硒，能够提高内皮细胞的抗氧化能力，延长角膜的保存时间。     

角膜中期保存液的研究进展

角膜保存液成分的改良是提高角膜内皮细胞活性的关键 ,并且直接影响着角膜移植手术的疗效。本文对角膜中期保存液的研究发展进行综述 ,重点介绍各种保存液的成分及其保存效果。角膜移植手术的不断开展和完善对供体角膜的保存提出了更高的要求。角膜保存的技术经过了一个半世纪的发展 ,已经取得了很大的进步 ,尤其是对角膜内皮细胞活性的研究 ,已成为衡量角膜保存方法可行与否的关键。依据角膜内皮细胞活性的有效时间 ,可将角膜保存技术分为短期、中期和长期。本文就角膜中期保存液的研究和发展作一综述。1　角膜保存技术的历史回顾184 7年 ,…     

三种不同方法保存的兔角膜内皮细胞形态学观察

目的 通过观察兔角膜内皮细胞形态,了解不同保存方法和不同保存时期及时间点对角膜内皮细胞活性和密度的影响.方法 采用短期湿房4 ℃保存6 h、D-X角膜中期保存液4 ℃保存3 d、长期深低温保存3个月,取3组各自限定时间的保存角膜片进行检测,分别行角膜内皮细胞茜素红和台盼蓝活性染色、光学显微镜观察及图像分析.结果 长期深低温保存后的兔角膜内皮细胞活性率、细胞密度及六边形细胞率低于前两组,细胞面积高于前2组,均具有统计学差异.结论 正确掌握3种方法,维持角膜内皮细胞生物活性,虽然深低温保存方法对角膜内皮细胞活性和密度有一定影响,但其活性率在80%以上,仍在角膜移植手术可接受的范围内.     

兔角膜内皮细胞的新法培养

目的：介绍一种全新的角膜内皮细胞培养方法。方法：在体视显微镜下撕下角膜后弹力层及内皮细胞层并剪切成小块,分置于培养皿中,将盖玻片叠加在组织块上进行培养。结果：角膜内皮细胞很快自组织块迁移生长,结论：本法培养内皮细胞不需用酶,具有简便,可靠,不易污染,细胞量大的优势,值得推广。     

软性角膜接触镜保存液中微生物污染调查

为了解软性角膜镜保存液中微生物污染情况，对９６名ＳＣＬ配戴者使用的保存液进行检测。结果，９６例保存液中８２瓶有细菌生长，２１瓶同时有真菌生长；分离出的２０２株细菌中１６８株，为革兰氏阴性菌；有１６瓶检出阿米巴，其中４瓶鉴定为棘阿米巴；阿米巴阳性保存液中微生物污染率和平均菌株检出数均高于阿米巴阴性保存液。     

透明质酸钠在角膜中期保存中的实验研究

目的:研究透明质酸钠(SH)在角膜中期保存中的作用.方法:在中期保存液(MMK液)中,加入SH制成保存液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(浓度分别为0.05%、0.03%、0.01%),以未加SH的MMK液作对照并作组间对照.对保存后的兔角膜片行大体和超微结构观察、内皮细胞苔盼兰-茜素红染色、琥珀酸脱氢酶(SDH)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)活性检测.结果:加入SH的三组所保存的角膜片其透明度、超微结构均好于对照组,角膜内皮细胞活性以实验Ⅰ组最高,对照组最低,各组间比较有显著性差异.结论:SH对角膜内皮细胞有明显的保护作用,可提高保存角膜的质量,延长保存时间,其效果与SH浓度有关.     

氟碳保存角膜的实验研究

目的　探讨氟碳在角膜中期保存中的应用价值。方法　将 6 0只新西兰兔角膜随机分为 3组 :( 1)空白对照组 ;( 2 )通氧组 ;( 3)实验组。每组角膜各 4 0片。空白对照组以Dexsol中期保存液常规保存 ;通氧组在常规保存同时持续通氧保存 ;实验组在通氧组基础上加入等量氟碳液保存。 3组保存 7d ,14d后观察角膜透明度和厚度 ,行组织细胞化学染色 (各组取 15片角膜 ) ,扫描电镜观察 (各组取 2片角膜 )及细菌学检查。结果　角膜透明度和厚度 :空白对照组、通氧组角膜外观灰白略显混浊 ,水肿、增厚 ;实验组角膜仅轻度水肿、增厚 ,外观仍透明。角膜内皮细胞密度及存活率 :实验组与空白对照组、通氧组相比较 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,实验组的内皮细胞形态活性有明显改善。结论　氟碳可有效改善角膜保存液的效果 ,改善中期保存的角膜质量     

保存液中添加bFGF对中期保存角膜细胞活性的影响

目的:研究bPGF对中期保存角膜细胞活性的影响.方法:配制保存液保存新西兰大白兔角膜,对照组为配制保存液保存,实验组为配制保存液加入bFGF(10ng/ml),两组在30～34℃恒温条件下保存16～18h后转入4℃低温保存,在保存3、5、7d分别取保存角膜片行30～34℃ 2h复温,台盼蓝-茜素红联合染色检测角膜内皮细胞活性、电镜检测细胞超微结构和PCNA检测细胞增殖情况.结果:加入bFGF实验组保存角膜,角膜水肿较轻、皱褶较少、透明度较高,角膜内皮细胞形态结构和活性较好(P＜0.05);并且角膜上皮、基质和内皮层有PCNA阳性细胞,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).结论:bFGF在中期角膜保存中有促进细胞增殖、保持角膜细胞活性的作用,可应用于中期角膜保存.     

Anti-inflammatory effects of a synthetic peptide derived from pigment epithelium-derived factor on H2O2-induced corneal injury in vitro

Background The common pathological characteristics of corneal injury include inflammatory factors activation, vascular endothelial cells or inflammatory cells infiltration into lesions, corneal edema, corneal neovascularization （CNV）, and scar formation. PEDF-34 is the functional fragment of pigment epithelium-derived factor （PEDF） that has anti-angiogenic and anti-inflammatory properties and contains an N-terminal 34-amino acid peptide. This study was to investigate the anti- inflammatory effects of PEDF-34 on H202-induced corneal injury in vitro. Methods After cultured in H202 （0.1 mmol/L） for 2 hours, human corneal fibroblasts （HCFs） and human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） were treated with PEDF-34-nanoparticles （NPs） at different concentrations （0.1, 0.5, 1.0, 2.0 μg/ml） or 2.0 μg/ml controI-NPs for 24 hours. The viable cells were quantified using the MTT assay. Western blotting or ELISA analysis was performed for measuring the human vascular endothelial growth factor （VEGF） and intercellular adhesion molecule-1 （ICAM-1） expression of both HCFs and HUVECs. VEGF and nuclear factor KB （NF-KB） mRNA levels of HCFs were semi-quantified by RT-PCR. Results The survival rates of HCFs or HUVECs stimulated by H202 did not decrease significantly （P 〉0.05） compared to those in the normal conditions. As compared to controI-NP group, PEDF-34-NPs had dose-dependent inhibitive effect on HUVECs with the MTT assay, but not HCFs. Western blotting analysis showed that the VEGF and ICAM-1 levels in the HCFs and HUVECs stimulated by H202 were significantly higher than those in the normal conditions, which were decreased dramatically in those treated with PEDF-34-NPs. RT-PCR analysis revealed that the VEGF mRNA and NF-KB mRNA levels increased in H202-stimulated HCFs, while both of them decreased in PEDF-34-NP groups dose dependently. Conclusions PEDF-34-NPs may play an important role in regulating the NF-kB pathway, inhibiting inflammatory activity. PEDF-34-NPs may be a potential new drug for treating corneal injury in the future.     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

有血清和无血清培养基联合法培养原代人牙龈上皮细胞

目的:探讨一种方便、快速、原代培养成功率高的人牙龈上皮细胞培养方法.方法:用含血清的DMEM培养基培养人牙龈组织上皮层7～10 d,然后换用无血清的EpiLife角化上皮细胞专用培养基加速已移出的上皮细胞分裂、增殖和游走.对培养出的上皮细胞进行组织学、形态学检测、单克隆角蛋白的鉴定和生长曲线测定.并比较联合培养方法和其他两种单独应用有血清DMEM培养基或无血清EpiLife培养基对上皮细胞生长的影响.结果:17～22 d内可获得供实验用上皮细胞,原代培养成功率为90.6%.倒置显微镜下见上皮细胞排列紧密,呈铺路石样生长.免疫组化染色角蛋白抗体阳性.同有血清培养基相比,无血清培养基能促进上皮细胞的迁移、游走,加速其分裂、增殖.结论:用有血清培养基和无血清培养基联合培养,可以方便、快速、成功地培养出人原代牙龈上皮细胞.     

自体血清对牛血清适应性人间充质干细胞增殖的影响

目的观察自体血清对牛血清适应性人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外增殖的影响.方法用10%的自体血清培养牛血清适应性hMSCs,分别以新生牛血清、胎牛血清及全程自体血清组作为对照,通过相差显微镜、细胞计数、MTT法、CCK-8(cell counting Kit-8)检测观察各组hMSCs的增殖状况.结果各组细胞均呈现正常的形态,细胞生长曲线相似,自体血清促进hMSCs体外增殖的效率与胎牛血清相似,较新生牛血清高;自体血清对牛血清适应性hMSCs的增殖效率有负面影响,但仍比新生牛血清更高.结论10%的自体血清对hMSCs具有与胎牛血清类似的良好促增殖作用,并对牛血清适应性hMSCs的促增殖效率有尚可接受的轻微不利影响.     

无血清培养基分离培养脐带间充质干细胞的研究

目的探讨应用无血清培养体系分离培养脐带间充质干细胞,明确其成骨生物学特性,为临床应用奠定实验基础。方法在无血清干细胞培养体系下,利用组织块贴壁培养法分离培养,扩增脐带间充质干细胞,在倒置显微镜进行形态学观察,流式细胞检测鉴定其表面标记CD34、CD44、CD90及CD45的表达,成骨诱导液培养2～3周后观察其细胞形态学变化,茜素红染色鉴定其成骨情况。结果脐带组织块接种后第1次更换培养液12h后,有少量梭形的细胞从脐带组织边缘爬出,培养5～6d左右成单层状生长,12d左右梭形状细胞呈现复层生长趋势,细胞表面标记CD44、CD90均呈阳性为间充干细胞来源,CD34、CD45均呈阴性为非造血干细胞来源;细胞经成骨诱导2～3周后具有良好的分化成骨能力。结论利用无血清的人间充质干细胞专用培养基培养体系,脐带组织培养法能够分离培养出大量的脐带间充质干细胞,避免了培养中异种蛋白的混入而降低临床排异反应。     

重组人内皮抑素两种给药途径抑制角膜新生血管的实验研究

目的:研究重组人内皮抑素(recombinant human endostatin,rHES,恩度)两种给药途径对碱烧伤诱导大鼠角膜新生血管的抑制作用. 方法:48只Wistar大鼠随机分为4组:A组(12只眼),对照组,不做处理;B组(12只眼),角膜碱烧伤后球结膜下注射生理盐水0.05ml,隔日1次;C、D组(各12只眼),右眼角膜碱烧伤后分别应用100mg/ml重组人内皮抑素点眼,4次/日和球结膜下注射0.05ml,隔日1次治疗.观察各组角膜新生血管的生长情况,免疫组化检测VEGF蛋白的表达.结果:C组、D组在碱烧伤后各时间点新生血管面积均小于B组,C组、D组与B组新生血管面积的差异有统计学意义(P<0.05);D组较C组对新生血管的抑制作用略强,差异无统计学意义(P>0.05).碱烧伤后第16天免疫组织化学检查显示除C组与D组间,其余各两两比较VEGF蛋白量差异有统计学意义,C组与D组VEGF蛋白量差异无统计学意义(P>0.05).结论:点眼和球结膜下注射重组人内皮抑素(恩度)即均可有效抑制CNV.