自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的培养及鉴定

目的：培养、鉴定自发性高血压大鼠主动脉平滑肌细胞,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法;采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测,绘制生长曲线、MTT法测定VSMC细胞的成活率、生长、增殖特征。结果：细胞生长曲线近似“S”形,VSMC传代周期为7-10d,呈典型“峰一谷”状生长,MTT法显示细胞生长第7～9天光密度值变化较明显,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达,第2代阳性结果强于4代。结论：正确的利用组织块可以简单、经济、高效地培养出VSCM,为VscM的治疗提供了理想的细胞模型。随传代过程细胞生物学特性发生改变。     

两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法比较

目的 比较两种人鼻咽癌活检组织上皮细胞原代培养方法,并初步探讨鼻咽癌原代培养细胞的生长特性.方法 收集未经放、化疗的鼻咽痛初诊病人鼻咽部肿瘤活检组织33例,其中17例采用组织块培养法.16例采用组织块预消化培养法,用含2%胎牛血清的Keratinocyte-SFM培养基培养.比较两种方法干贴壁时间、成功率及细胞长出所需平均天数,并通过倒置显微镜、抗人角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学染色、生长曲线、生存分析来观察原代培养细胞的特性.结果 组织块培养法成功率为23.5%(4/17),干贴壁时间为4.47±0.48h,细胞长出所需时间为13.75±1.5d;组织块预消化培养法成功率为62.5%(10/16),干贴壁时间为7.88±1.01 h,细胞长出所需时间为8.3±4.55d,差异有统计学意义(P<0.05).组织块培养法,细胞多层重叠排列,结构不清,始终没有继续繁殖生长;组织块预消化培养法,细胞呈梭形,核大居中,多个核仁,抗人角蛋自单克隆抗体免疫细胞化学染色阳性,生存时间均数为62.72d.结论 组织块预消化培养法较组织块法成功率高,细胞长出所需平均天数短,干贴壁时间长;低浓度血清的Keratinocyte-SFM培养基适合鼻咽癌原代上皮细胞体外培养.     

人大肠癌细胞体外分离与培养

目的:探讨人大肠癌细胞体外分离培养的方法.方法:采用组织块法和Ⅳ胶原酶消化法体外培养人大肠癌细胞,HE染色、免疫细胞化学判断细胞的组织来源、TEM观察细胞形态,MTT法绘制细胞生长曲线.结果:采用组织块法细胞培养成功,HE染色显示核大蓝染, 细胞角蛋白鉴定胞浆黄染,细胞角蛋白阳性;透射电镜下,见细胞内丰富的线粒体、表面微绒毛、细胞间连接复合体结构;细胞生长曲线为"S".结论:组织块法原代培养细胞成功率高,需注意在取材、分离操作过程中保持无菌,所培养的细胞进行初步鉴定证明为大肠癌细胞.     

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的 采用倒置显微镜、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜(( laser scanning confocal microscopy,LSCM))技术对大鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSMGs)与丝素-壳聚糖( silk fibroin-chitosan,SFCs)的体外复合培养进行形态学观察.为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持.方法 取0～8d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体( CK8)及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源.选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜(5×5×2)mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构.将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况.结果 倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行.SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构.经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞.荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内.LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息.结论 四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测.LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值.     

酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究

目的 提高人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPIF)原代培养的成功率,快速建立体外细胞研究模型。方法 采取组织块与酶消化相结合的方法处理牙周膜组织块,获取细胞;用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源,通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果 原代培养成功率为77．8％。获得的细胞呈梭形,抗波形丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,符合人牙周膜成纤维细胞的形态学特征和生物学特性,生长良好。结论 酶消化组织块法可显著提高人牙周膜成纤维细胞原代培养成功率,方法可行。     

探讨年龄因素对人黄韧带细胞原代培养的影响

[摘要]目的 探讨从不同年龄的人获得黄韧带组织与原代培养细胞游出之间的关系, 以提高黄韧带细胞原代培养的成功率。方法 采用酶消化加组织块培养法,对21例来自不同年龄腰椎管狭窄和腰椎间盘突出症患者的黄韧带组织进行黄韧带细胞原代培养, 倒置相差显微镜下观察细胞从组织块迁出时间、形态和生长状态;采用细胞免疫荧光染色法对传第3代细胞进行I 型胶原和波形蛋白表达鉴定;对组织块内细胞游出率和年龄进行相关性分析。结果 倒置显微镜下见黄韧带细胞形态生长良好,培养细胞的波形蛋白和 I 型胶原免疫荧光化学染色均呈阳性。黄韧带组织块年龄与其原代培养时细胞游出率之间呈显著负相关关系(r=-0.618),年轻黄韧带组织细胞游出率高。结论 在人黄韧带细胞的原代培养时尽量采用年轻黄韧带组织。     

酶消化组织块法培养人牙髓细胞

目的建立用酶消化组织块培养人牙髓细胞的方法。方法用酶消化组织块进行人牙髓细胞体外培养,倒置显微镜和透射电镜分别观察牙髓细胞形态、生长情况和超微结构,取第5代牙髓细胞测定生长曲线、免疫组化法鉴定组织来源,并检测其矿化能力。结果用酶消化组织块培养的人牙髓细胞成纤维细胞样,接种4天大部分组织块能有效贴附于培养瓶壁,第7天可见组织块边缘有细胞延展生长,第14天复层生长,呈网状,可顺利传代;牙髓细胞抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;细胞I型胶原染色阳性,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节,符合牙髓细胞的形态学特征和生物学特性。结论酶消化组织块培养人牙髓细胞方法简单可行,具有较高的成功率。     

以膀胱脱细胞基质为支架材料体内外构建组织工程化尿路上皮

目的:探讨利用组织工程技术体内外构建尿路上皮组织的方法.方法:制备新西兰兔膀胱脱细胞基质材料(bladder acellular matrix graft,BAMG),通过Masson染色和扫描电镜观察材料结构特点.酶消化法获取兔膀胱上皮细胞,体外培养扩增,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,并以免疫组织化学方法进行细胞鉴定.将膀胱上皮细胞与BAMG体外复合培养,HE染色和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况.将体外培养的细胞-材料复合物植入裸鼠体内,分别在4周和8周取材,进行大体观察、组织学以及免疫组织化学方法检测.结果:制备的BAMG呈白色半透明薄膜状,扫描电镜下为纤维网状结构,无细胞残留.体外培养的膀胱上皮细胞呈"铺路石"样外观,抗细胞角蛋白AE1/AE3免疫组化染色胞浆呈棕黄色阳性反应.膀胱上皮细胞接种到BAMG 7 d后,细胞铺满材料的表面,呈单层细胞结构.裸鼠体内植入4周和8周后,细胞-材料复合物形成多层细胞结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色呈阳性.结论:采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮组织,这可为进一步进行组织工程泌尿道修复及重建奠定基础.     

子宫平滑肌瘤细胞原代培养及鉴定

目的:建立人子宫平滑肌瘤细胞原代培养方法,为子宫肌瘤发病机制及治疗药物筛选的研究提供理想的细胞株系.方法:采用消化法及组织块贴壁2种方法进行子宫平滑肌瘤细胞培养.倒置显微镜下观察原代培养的细胞,并用免疫组化染色对其进行鉴定.结果:2种方法均可获得大量子宫肌瘤细胞,所培养的细胞在倒置显微镜下呈梭形和典型"峰-谷"样生长,α-Actin免疫组化染色呈强阳性.结论:采用该2种方法均可成功进行人子宫平滑肌瘤细胞的原代培养,且培养的人子宫平滑肌细胞生长良好,纯度高,可用于子宫肌瘤发病机制及治疗药物筛选的研究.     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的 探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法.方法 采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶I联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代.并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色.结果 倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性.结论 建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.     

导电聚吡咯膜细胞培养技术培养的大鼠角朊细胞的生物学特性

目的：探讨导电聚吡咯膜细胞培养技术是否会改变细胞的生物学特性。方法：应用形态学观察，分子荧光探针及划痕标记染料示踪技术，在细胞形态学，超微结构，细胞膜流动性以及细胞间通讯连接功能等方面，对采用导电聚吡咯膜细胞培养技术和常规培养技术培养的大鼠角朊细胞的生物学特性分别进行检测与比较。结果：使用导电聚吡咯膜细胞培养技术培养的大鼠角朊细胞，在细胞形态学，超微结构，细胞膜流动性以及细胞间通讯连接功能等方面，与常规方法培养的大鼠角朊细胞相比未观察到异常改变。结论：在现有实验条件下，导电聚吡咯膜细胞培养技术不会改变所培养的大鼠角朊细胞的生物学特性。     

4种检测IgG红细胞抗体方法的比较

目的比较木瓜蛋白酶、抗球蛋白实验、聚凝胺和微柱凝胶4种检测IgG红细胞抗体方法的特异性、敏感性、效价及所需时间.方法将12种IgG抗体:抗-D、抗-E、抗-C、抗-c、抗-e、抗-Jka、抗-Jkb、抗-Fya、抗-Fyb、抗-k抗-S、抗-s分别采用上述4种方法检测.结果木瓜蛋白酶检出了抗-D、抗-E、抗-C、抗-c、抗-e、抗-Jka、抗-JKb7种抗体(7/12);抗球蛋白试验检出了所有12种抗体(12/12);聚凝胺法检出了除抗-k以外的抗体(11/12);而微柱凝胶也检出了所有12种抗体(12/12).木瓜蛋白酶检测Rh及Kidd血型系统的抗体效价低于其它3种方法,而微柱凝胶检测这12种抗体效价较其它3种方法更为敏感.4种方法检测IgG抗体所需时间分别为:木瓜蛋白酶45min,抗球蛋白实验60min,聚凝胺5 min,微柱凝胶30 min.结论木瓜蛋白酶检测IgG抗体具有一定的局限性;抗球蛋白实验因需要反复洗涤红细胞费工费时;聚凝胺是目前最快速简便检测IgG抗体的方法;而微柱凝胶是检测IgG抗体最为敏感的方法.     

单个胃肠道平滑肌细胞的分离及其细胞膜离子通道检测

目的:建立胃肠道平滑肌细胞的分离及离子通道检测方法,为胃肠道动力性疾病和离子通道相关性疾病的研究提供技术平台。方法:酶消化法急性分离胃肠道平滑肌细胞,运用离子通道膜片钳技术在全细胞模式下检测单个平滑肌细胞膜上离子通道的状况。结果:用酶消化法急性分离可获得细胞膜完整生物活性状态良好的单个胃肠道平滑肌细胞,该细胞符合膜片钳实验的要求;运用离子通道膜片钳技术在全细胞模式下可以记录基础状态和干预后单个胃肠道平滑肌细胞细胞膜上离子通道的开放状况,可用于相关的病理、生理、药理研究。结论:酶消化急性分离法是获得单个胃肠道平滑肌细胞的一种简单、有效、易操作的方法,运用该方法结合离子通道膜片钳技术可以准确记录胃肠道平滑肌细胞细胞膜上离子通道的开放状况。     

紫杉醇-顺铂联合药物控释系统对肺腺癌细胞系 A549细胞生长的抑制作用

目的：观察以聚碳酸亚丙酯乳液作为纺丝液,采用静电纺丝技术,负载紫杉醇和顺铂制备的载药纤维控释系统对体外培养的肺腺癌细胞系 A549的抑制率,为进一步的动物实验奠定基础,并探讨用于肺癌治疗的可行性。方法体外培养肺腺癌细胞系 A549。分别比较紫杉醇、顺铂和两药联合纤维载药控释系统与其相应的裸药对照组对 A549的抑制率。肿瘤细胞生长抑制率测定采用酶标仪测定吸光度（490 nm 波长）。药物对肿瘤细胞抑制率=（对照组吸光度-实验组吸光度值）/对照组吸光度。结果紫杉醇单药、顺铂单药和两药联合的载药纤维控释系统对肺癌细胞 A549的生长的抑制率均强于相应的裸药组。顺铂单药和两药联合的载药纤维控释系统的肿瘤细胞抑制率随药物浓度的增加而呈明显的上升趋势。结论聚碳酸亚丙酯负载紫杉醇和/或顺铂静电纺丝制备控释给药系统可显著抑制体外培养的肺腺癌细胞系 A549的生长。该给药系统有望实现抗癌药物解剖靶向控释给药。     

人表皮生长因子的三种分离方法及其生物学活性

人表皮生长因子(hEGF)是细胞生长因子之一。本文提出了从人尿中分离hEGF的简单、易行的新方法,并与另外二种方法做了比较。其生物活性用角膜组织培养后,能使角膜上皮,前界膜明显增厚,并使角膜固有层的成纤维细胞的数目明显增多。     

人肺腺癌细胞系GLC-82中p21WAF1和p53基因的过表达

目的 探讨p21^WAF1和p53基因过表达对人肺腺癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法 用带有p21cDNA的真核表达载体pCEP和带有p53的腺病毒表达载体pAdCMV,分别通过基因转染和腺病毒感染,使其在人肺腺癌细胞系(GLC—82)中过表达;通过流式细胞仪、透射电镜和原位末端分析(TUNEL)观察细胞的生长和凋亡情况。结果 p21过表达的细胞系G1期细胞增加,细胞生长抑制,克隆形成率下降,电镜下未见特征性凋亡小体,原位细胞凋亡分析未见凋亡信号;p53腺病毒感染的肿瘤细胞增殖明显抑制并出现死亡,原值细胞凋亡检测到凋亡信号。结论 P21和p53基因的过表达能够抑制人肺腺癌细胞的生长,其中p53能够诱发细胞凋亡,因此这两种基因在肿瘤基因治疗上有着广泛的应用前景。     

肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因RNA干扰的体外研究

目的 体外研究特异的小干扰RNA(siRNA)对肺腺癌细胞A549 hnRNP B1 基因表达及生长的抑制作用. 方法设计和构建由H1启动子驱动产生的特异的hnRNP B1 siRNA 表达质粒,转染至A549细胞,荧光定量PCR法及Western blot检测hnRNP B1基因的表达,MTT法检测该表达质粒转染后对A549细胞生长的影响.结果 针对hnRNP B1 基因构建的重组质粒具有明显的干扰效果,受特异hnRNP B1 siRNA 干扰的A549细胞hnRNP B1 mRNA及蛋白表达下调,细胞生长受到抑制.结论 应用RNA干扰技术可阻止hnRNP B1基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向.     

兔VX2肝癌模型制作及肝动脉插管技术改良

目的 应用VX2细胞株制作新西兰兔移植性肝癌模型,并探讨对肝动脉插管技术的改良.方法 开腹分别种植VX2瘤块于兔肝左、右叶.制作40只兔VX2肝癌模型.瘤株接种2周后,实验组(26只)采取改良显微外科手术直接行肝动脉插管法行介入治疗,对照组(10只)采用3F微导管经股动脉.肝动脉插管法作对比研究.术前及术后用多层螺旋CT和DSA造影方法进行兔VX2肝癌的影像学观察.结果 CT扫描及开腹手术证实瘤株接种成功36只.实验组的插管成功率为88%(23/26);对照组的插管成功率为40%(4/10).多层螺旋CT平扫兔VX2肝癌表现为低或等密度结节灶;DSA造影示肿瘤呈均一的或结节状染色.结论 采用改良显微外科手术直接行肝动脉插管法对兔VX2肝癌行介入治疗成功率较高,实验人员可较大程度地避免辐射,是值得推广的实验方法.     

耐药肺腺癌细胞株A549/CDDP生物学特性及染色体核型分析

目的 建立氯氨顺铂诱导肺腺癌耐药细胞株A549／CDDP。分析A549／CDDP生物学特性及染色体核型，为肺腺癌的治疗提供实验依据。方法 采用氯氨顺铂（Cis—diaminodichloroplatin，CDDP）大剂量冲击加逐步诱导法建立肺腺癌耐药细胞株A549／CDDP，MTT法检测细胞耐药指数．生物发光法测定细胞能量代谢，流式细胞仪测试细胞周期，染色体G显带技术和光谱核型分析（spectral karyotyping，SKY）技术分析染色体变化。结果 MTT检测结果表明。A549／CDDP对7种不同的化疗药物表现了不同的耐药性，其ATP、ADP、AMP含量显著降低，细胞周期无明显变化。G显带结果表明A549／CDDP染色体为亚三倍体，SKY分析出现数条衍生染色体。结论 CDDP可以成功诱导肺腺癌耐药细胞株A549／CDDP，A549／CDDP衍生染色体可能与肺腺癌耐药有关。     

Tipe2过表达对小细胞肺癌H446细胞迁移的影响

目的观察Tipe2过表达对小细胞肺癌H446细胞迁移的影响及可能机制。方法以脂质体转染技术建立Tipe2过表达的H446小细胞肺癌细胞系,利用荧光显微成像技术、Western Blot免疫印迹技术和细胞划痕实验分别检测Tipe2蛋白表达情况,细胞信号Erk1/2、p38、p65通路激活情况和细胞迁移能力变化。结果 GFP-Tipe2质粒转染H446细胞成功高表达Tipe2并带有标签GFP的绿色荧光。Tipe2过表达抑制Erk1/2通路磷酸化、抑制NF-κB通路p65磷酸化、增强p38通路磷酸化。H446-Tipe2组在48 h细胞迁移运动明显比H446-Vector组划痕区间宽,细胞运动缓慢。结论 Tipe2过表达抑制Erk1/2和NF-κB通路并激活p38通路,并且抑制H446的细胞迁移运动。