对尿道下裂大鼠生殖结节中lncRNA表达的初步研究

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)在邻苯二甲酸二丁酯(DBP)诱导的尿道下裂大鼠生殖结节中的表达 方法 在孕鼠孕13-18天时按体重800mg/kg DBP溶于1ml玉米油灌胃,对照组每天给予1ml玉米油。于孕19天时取出胎鼠,分别取下灌药组发生尿道下裂和对照组雄性胎鼠的生殖结节,提取RNA,构建RNA测序文库测序。对测序结果的lncRNA进行筛选、差异分析和功能预测,再随机筛选4条lncRNA用qRT-PCR验证其表达量。结果 与对照组相比,尿道下裂组生殖结节中有195个差异lncRNA,136个差异mRNA,qRT-PCR结果与测序结果一致。差异lncRNA功能最多分布在生长激素释放激素受体的结合;分布最多的的信号通路为金葡菌感染通路 结论 邻苯二甲酸二丁酯诱导的尿道下裂雄性大鼠与正常雄性大鼠相比,其生殖结节中lncRNA和mRNA显著改变,lncRNA可能通过与mRNA相互作用参与到尿道下裂形成过程中生殖结节的发育。     

Wnt/β-catenin与NF-κB信号通路在邻苯二甲酸二丁酯诱导雄性大鼠发生尿道下裂中的表达

目的: 利用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕晚期暴露诱导子代SD大鼠发生尿道下裂,验证Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)及核因子κB(NF-κB)信号通路中关键蛋白在胎鼠生殖结节中的差异表达,探讨该通路在DBP致大鼠生殖系统发育异常过程中的作用机制?方法:孕SD大鼠20只,随机分为DBP组和对照组,在妊娠(GD)14~18天,每天分别通过灌胃给予DBP和大豆油800 mg/kg,于GD 19天处死后取胎鼠,鉴别出DBP组中发生尿道下裂的雄性胎鼠及对照组中的雄性胎鼠,分为尿道下裂组与正常对照组,提取生殖结节组织,Western blot检测β-catenin?糖原合成酶-3β(GSK-3β)和NF-κB的表达情况?结果:DBP染毒后子代雄性胎鼠出生体重较对照组明显下降,肛门生殖器距离(AGD)明显缩短,尿道下裂发生率为46.7%,同时尿道下裂组与正常对照组中β-catenin相对表达量的比值为0.505±0.014(P < 0.05),GSK-3β与NF-κB相对表达量的比值分别为1.903±0.018和3.661±0.021(P均< 0.05)?结论:DBP可能通过干预生殖结节中Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路的正常表达导致尿道下裂的发生?     

Akt信号通路在邻苯二甲酸二丁酯诱导雄性胎鼠发生尿道下裂中的表达研究

目的:邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)孕晚期暴露诱导子代Spraque-Dawley大鼠发生尿道下裂,探讨Akt信号通路及其下游关键蛋白核转录因子κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)在胎鼠生殖结节中的差异表达,研究该通路在DBP致大鼠生殖系统发育异常过程中的作用机制?方法:孕SD大鼠20只,随机分为染毒组和对照组,在妊娠时间(gestation day,GD)14~18 d,每天通过灌胃分别给予DBP 800 mg/kg和大豆油,在 GD19时提取染毒组发生尿道下裂胎鼠与对照组胎鼠的生殖结节组织,用Western blot检测磷酸化Akt(p-Akt)?Akt和NF-κB的表达情况,同时用免疫组化分析p-Akt的表达情况?结果:尿道下裂组与对照组中p-Akt?Akt和NF-κB相对表达量的比值分别为3.057 ± 0.026?2.624 ± 0.073和3.524 ± 0.035(n = 10,P < 0.05),且尿道下裂组中p-Akt蛋白相对量在总蛋白中所占的比例较对照组高?p-Akt定位于生殖结节上皮细胞,尿道下裂组p-Akt染色明显强于对照组? 结论:DBP干预大鼠生殖结节中Akt信号通路及其下游NF-κB的正常表达,进而影响了上皮细胞增殖?凋亡及尿生殖褶的融合,这可能是尿道下裂发生的机制之一?     

邻苯二甲酸二丁酯干预Fgfs信号通路致雄性仔鼠尿道下裂发生的分子机制研究

目的:通过验证邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕期染毒所致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节内成纤维细胞生长因子(Fgfs)及其受体(Fgfr)信号通路中关键基因的表达异常,探讨其在DBP生殖毒性过程中的作用机制.方法:孕鼠20只,随机分2组,在怀孕(GD)14～18天期间,每天分别灌胃给予大豆油、DBP 750 mg/kg,出生后第1天(PND1),统计仔鼠出生数、尿道下裂发生率,称量雄性仔鼠体重,肛门至生殖器距离(AGD);PND7,取尿道下裂雄性仔鼠生殖结节,用实时定量(real-time quantitative)RT-PCR方法检测生殖结节中Fgf8、Fgf10、Fgfr2的mRNA表达水平.结果:DBP染毒后导致新生仔鼠与正常组相比数量明显减少,雄性仔鼠体重明显下降、AGD明显缩短,雄性仔鼠尿道下裂的发生率为48.83%.同时,与对照组相比,DBP致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节中Fgf8、Fgf10、Fgfr2的mRNA的表达水平明显下降.结论:DBP对母体有着明显的毒性作用,DBP干预了Fgfs信号通路中关键基因的表达,这可能是DBP导致生殖结节发育异常,引起尿道下裂的重要原因.     

宫内发育迟缓小鼠妊娠期胰岛lncRNA和mRNA的表达谱分析

目的：对正常孕鼠和宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation,IUGR)小鼠孕期胰岛RNA进行高通量测序分析, 筛选出差异表达的长链非编码RNA(long non?coding RNA,lncRNA)和信使RNA(messenger RNA,mRNA),为深入探讨IUGR孕鼠胰岛功能障碍的发病机制提供理论基础。方法：提取IUGR成年后孕鼠和正常孕鼠胰岛RNA并进行高通量测序,筛选出差异表达的lncRNA和mRNA,进行lncRNA和mRNA关联分析,对lncRNA相关的靶mRNA进行GO功能注释分析、KEGG通路富集分析,重点关注高差异表达且可能影响孕期胰岛功能的lncRNA。结果：IUGR孕鼠和正常孕鼠差异表达的lncRNA 1 007个, 其中483个上调,524个下调;差异表达的mRNA 50个,其中22个上调,28个下调。对差异lncRNA的靶mRNA和差异mRNA进行功能分析,GO分析示它们参与的生物学途径集中于细胞及组织过程、生物调节、代谢及应激过程;分子功能集中在整合、催化活性、转运活性、分子功能调节等方面;KEGG分析示它们主要集中在代谢、癌症、次生代谢产物的生物合成、PI3K?AKT及 MAPK 通路。对差异表达的lncRNA FTX 和Neat1进一步分析表明,IUGR 孕鼠和正常孕鼠的FTX 表达量分别较未孕时下降 (P ＜ 0.001),而 Neat1上升(P ＜ 0.01);FTX、Neat1表达量在IUGR孕鼠和正常孕鼠间有显著差异(P ＜ 0.05),且表达量受糖浓度调节。lncRNA FTX与其靶mRNA均为反式(trans)作用,lncRNA Neat1与Frmd8为顺式(cis)作用,余为trans作用。结论：本研究筛选出IUGR孕鼠和正常孕鼠胰岛中差异表达的lncRNA和mRNA,lncRNA通过不同互作关系调控靶mRNA,调节糖代谢过程。     

Lamin B1在邻苯二甲酸二丁酯致大鼠尿道下裂发生中的表达变化

目的:利用邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)胚胎晚期暴露导致SD胎鼠尿道下裂发生的动物模型,验证Lamin B1在尿道下裂与正常胎鼠阴茎中的差异表达,以进一步探讨尿道下裂的发生机制?方法:妊娠14~18天 SD雌鼠20只,随机分为2组,实验组和对照组分别给予DBP 800 mg/(kg·d)和大豆油2 ml/d灌胃,孕期第19天剖宫产后记录雄性胎鼠肛门和生殖器之间的距离(AGD)?出生体重(BW)及尿道下裂发生数,取雄性胎鼠阴茎,运用免疫印迹法和免疫组织化学方法分析Lamin B1的表达情况?结果:实验组AGD/BW与对照组相比有显著性差异(P < 0.05);尿道下裂发生率为40%;Lamin B1在对照组的相对表达量为0.923±0.013(n=10),实验组为0.593±0.014(n=10),差异有统计学意义(P < 0.05);Lamin B1主要定位于尿道上皮细胞,对照组染色强度明显强于实验组?结论:DBP灌胃期间改变了尿道组织中Lamin B1的表达,影响了细胞迁移和尿生殖褶的融合,这可能是尿道下裂发生的原因之一?     

邻苯二甲酸二丁酯诱发大鼠尿道下裂模型的建立

目的:尝试用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)建立尿道下裂大鼠模型。方法:孕鼠30只,随机分成2组:①实验组(DBP)15只;②对照组(大豆油)15只。在大鼠怀孕12～20天期间,2组每天分别给予灌胃,实验组予DBP500mg/(kg·d),对照组予大豆油,灌胃容积均为每只1ml/d。待孕鼠分娩完毕,即对新生大鼠计数并在解剖显微镜下测量雄性新生鼠的肛门生殖器距离(AGD)和称体重。在雄性仔鼠出生后70天逐个检查尿道下裂的发生情况。结果:①DBP成功诱导出了雄性大鼠尿道下裂畸形,对照组大鼠的生殖器未见异常改变;②实验组新生大鼠的AGD缩短,但无统计学差异;实验组新生大鼠体重明显减轻,有显著统计学差异。结论:①成功建立了尿道下裂大鼠模型;②为人类小儿尿道下裂的病因学研究和防治提供科学的实验依据。     

邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯通过氧化应激、凋亡诱导大鼠尿道下裂

目的 探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱导大鼠发生尿道下裂的发生机制.方法 20只成年孕SD大鼠[10 ～ 12周龄,体质量(240 ±20)g]按完全随机分为:玉米油对照组[750 mg/(kg·d),n=10]和DEHP暴露组[750 mg/(kg·d),n=10],于妊娠期(gestation day,GD)第8.5 ～18.5日每日灌胃,于GD19.5时剖宫取出胎鼠,以有无睾丸分辨雌雄,并在解剖显微镜下观察有无尿道下裂的发生,将DEHP暴露组有尿道下裂的列入尿道下裂组,以玉米油对照组雄性无尿道下裂的胎鼠作为正常对照组.测量雄鼠胎鼠的肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD)和肛门生殖指数(anogenital index,AGI),扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态改变情况,高效液相色谱法检测胎鼠肝脏中的维生素A、E水平,Westem blot检测阴茎组织中氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1、SOD1、Gpx和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl2的表达水平,TUNEL法检测阴茎组织中的细胞凋亡.结果玉米油对照组胎鼠无尿道下裂发生,DEHP暴露组胎鼠出现尿道下裂,发生率为27.59％.与正常对照组相比,尿道下裂组AGD、AGI均明显降低(P＜0.05);尿道下裂胎鼠阴茎出现腹侧尿道皱褶融合障碍及尿道口开口异常;此外,尿道下裂胎鼠体内维生素A、E的水平明显降低(P＜0.05);阴茎组织中Nrf2、HO-1、Gpx、SOD1和Bcl2蛋白表达水平明显下降(P＜0.05),cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平则明显增高(P＜0.05),细胞凋亡显著增加(P＜0.05).结论DEHP诱导SD大鼠发生尿道下裂,可能与机体氧化应激失衡、Nrf2-HO-1信号通路被抑制后阴茎组织中细胞凋亡异常增加有关.     

邻苯二甲酸二乙酯诱导的大鼠尿道下裂与Mafb的表达相关:基于转录组测序结果

目的通过转录组测序筛选大鼠尿道发育过程中相关差异基因,并进行验证;探究邻苯二甲酸二乙酯（DEHP）诱导SD大鼠 尿道下裂的发生机制。方法40只成年SD孕鼠随机分成4组（n=10）,前两组予以空白对照处理,分别于妊娠期16 d（GD16组） 和GD19 d（GD19组）剖宫产取出雄性胎鼠,将收集好的胎鼠阴茎组织进行转录组测序,lllumina HiSeq 2000筛选出差异表达基 因（DEGs）,然后对DEGs进行差异基因功能（GO）和pathway显著富集性分析;选取其中的DEG（Mafb）进行免疫荧光验证。后 两组分别予以玉米油（对照组）和DEHP [750 mg/(kg·d)]（DEHP暴露组）于GD12 d至GD19 d每日灌胃处理,GD19 d剖宫产取 出雄性胎鼠,并判断有无尿道下裂的发生。扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态学改变,免疫荧光和Western blot检验阴茎组 织中Mafb、β-catenin的表达水平。结果GD19组胎鼠阴茎组织与GD16组胎鼠阴茎组织转录组测序结果示1360个DEGs（其中 上调797个,下调563个）,差异基因主要富集于细胞粘着斑信号通路、轴突导向信号通路、细胞外基质受体作用信号通路等,选 取DEG（Mafb）进行免疫荧光验证,发现Mafb的表达随发育显著增加,与测序结果相符。而DEHP暴露组胎鼠阴茎组织与对照 组胎鼠阴茎组织相比,Mafb、β-catenin表达水平显著下调（P<0.01）。结论随着大鼠阴茎组织的正常发育,Mafb的表达逐渐增 加;而DEHP暴露组较对照组Mafb、β-catenin表达显著下调,提示β-catenin信号通路影响Mafb表达可能与DEHP诱导大鼠尿道 下裂发生相关。     

氟他胺对胚胎期尿道下裂大鼠PCNA、AR表达的影响

目的观察氟他胺(Flu)对胚胎期SD大鼠尿道及睾丸间质细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、雄激素受体(AR)表达水平的影响,探讨其引起尿道下裂机制。方法将孕鼠于第12～17天连续皮下注射Flu(6.0546 mg/kg.d)染毒造模,在第20天行破宫产取子代雄鼠的尿道生殖结节和睾丸,用免疫组化检测大鼠尿道生殖结节、间充质细胞、尿道细胞及睾丸间质细胞PCNA、AR表达变化,RT-PCR技术检测睾丸间质细胞PCNA、AR mRNA表达变化。结果免疫组化显示PCNA在Flu染毒组大鼠生殖结节、间充质细胞、尿道细胞及睾丸间质细胞中蛋白表达明显低于对照组(P<0.05),AR在Flu染毒组尿道细胞及睾丸间质细胞表达与对照组无差异(P>0.05);RT-PCR显示:PCNA mRNA在Flu染毒组大鼠睾丸间质细胞中蛋白表达明显低于对照组(P<0.05),AR mRNA在Flu染毒组睾丸间质细胞表达与对照组无差异(P>0.05)。结论 Flu引起尿道下裂不是通过改变AR水平实现,可能是通过降低睾酮激素水平或与雄激素竞争性结合AR而导致尿道下裂的发生。