首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到10条相似文献,搜索用时 15 毫秒
1.
目的:建立猪naive-like诱导性多能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞系,并对其进行红色荧光标记,为通过示踪猪naive iPS细胞发育和分化的相关研究奠定基础。方法:首先利用核转染技术向巴马小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)中转入鼠源OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转录因子表达载体TetO-FUW-OSKM,并同时转入激活表达载体FUW-M2rtTA,采用白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的培养体系进行培养,通过在培养液中添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX) 进行诱导,建立起猪iPS细胞系,并对细胞系的多能性进行鉴定。在此基础上,向iPS细胞系转入红色荧光蛋白表达载体,对其进行标记,并鉴定被红色荧光标记后的细胞是否仍然具有多能性。结果:所建立的iPS细胞系克隆呈三维立体生长,可以进行单细胞传代培养至30代以上,核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达多种干细胞多能因子,利用LIF/STAT3信号通路维持其增殖,体外可分化形成表达三胚层相关基因的类胚体,为猪naive-like iPS细胞系。成功对所建立的iPS细胞系进行红色荧光标记,碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色结果显示被红色荧光标记的iPS细胞的多能性依然存在。结论:成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的猪naive-like iPS细胞系。  相似文献   

2.
目的:在STO小鼠成纤维细胞中表达猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),并尝试使用其作为饲养层培养大鼠诱导多能性干细胞(iPS细胞)?方法:通过脂质体转染的技术,将已构建的猪LIF基因真核表达载体pCAG-pLIF转染至小鼠STO细胞中,获得能够稳定表达猪LIF的转基因STO细胞(STO-pLIF细胞)?通过RT-PCR?qPCR?Western blot等方法检测STO-pLIF细胞中猪LIF基因的表达量,选择高效表达猪LIF的STO-pLIF细胞作为饲养层,培养大鼠iPS细胞?通过生长曲线检测?碱性磷酸酶染色?干细胞多能因子的RT-PCR和免疫荧光染色等方法,检验STO-pLIF细胞饲养层在大鼠iPS细胞培养方面的功能?结果:STO-pLIF细胞中LIF RNA和蛋白表达水平均上调(P < 0.05),而该细胞系作为饲养层所培养的大鼠iPS细胞在形态?多能性因子表达方面更接近于传统培养的大鼠iPS细胞,与无外源添加LIF所培养的大鼠iPS存在差异(P < 0.05)?结论:成功获得了稳定表达猪LIF基因的STO-pLIF细胞,并证明该细胞作为饲养层在大鼠iPS细胞培养中具有一定优势?  相似文献   

3.
通过反转录病毒载体系统,在小鼠和人高度分化细胞中表达干细胞因子Oct4,Sox2,Klf4和(或)c-Myc等基因,再经过干细胞标志因子Nanog等的筛选,可以获得与ES细胞特性十分近似的诱导多能干细胞系(iPS).本文主要综述了诱导多能干细胞最近的研究现状,并对诱导重编程的机制和诱导多能干细胞系的临床应用前景进行了讨论.  相似文献   

4.
目的:检测microRNA?1247(miR?1247)在骨肉瘤细胞系中的表达及对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响和机制。方法:采用实时荧光定量PCR(qRT?PCR)测定miR?1247在人正常成骨细胞系(U2OS、Saos?2、143B)及人骨肉瘤细胞系(hFOB1.19)中的表达,将Saos?2细胞系分成两组,即miR?1247过表达组(miR?1247组)和阴性对照组(EV组),采用LipofectamineTM 2000分别转染miR?1247 mimics和阴性对照序列scramble,采用MTT法和流式细胞术测定增殖和凋亡,Western blot检测SOX9和FAM129B的表达。结果:miR?1247在骨肉瘤细胞系中的相对表达量低于人正常成骨细胞系,差异有统计学意义(P < 0.05)。转染后0、1、3 d,EV组与miR?1247组细胞增殖水平差异无统计学意义(P > 0.05);转染后5、7 d,miR?1247组细胞增殖水平低于EV组,差异有统计学意义(P < 0.05)。miR?1247组细胞凋亡率高于EV组,差异有统计学意义(P < 0.01)。 miR?1247组SOX9和FAM129B蛋白表达量低于EV组,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论:miR?1247在骨肉瘤细胞系中低表达,miR?1247上调表达可抑制细胞增殖并诱导凋亡,其机制可能与SOX9和FAM129B蛋白下调表达有关。  相似文献   

5.
目的:构建过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα转基因小鼠,筛选高表达稳定遗传系,建立PP2A Cα基因相关功能研究模型动物。方法:将Flag蛋白标签序列与鼠源PP2A Cα cDNA 转录本设计成融合基因,插入CAG启动子下游,构建过表达载体pCAG?3×flag?PP2A Cα。通过原核显微注射技术,将线性化pCAG?3×flag?PP2A Cα质粒注射入受精卵雄原核,构建pCAG?3×flag?PP2A Cα过表达模型小鼠,PCR筛选阳性过表达小鼠。提取阳性过表达小鼠组织总蛋白,在蛋白质水平分析转基因小鼠3×flag?PP2A Cα的表达。结果:PCR 鉴定及测序结果证实,pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因载体及过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因小鼠模型构建成功。Western blot筛选转基因高表达系小鼠。结论:筛选得到pCAG?3×flag?PP2A Cα高表达稳定遗传系小鼠。  相似文献   

6.
目的:探讨Notch3在顺铂诱导的人肾小管上皮细胞(HK?2)损伤中的表达变化及其潜在的相关上游微小RNA(microRNA,miRNA)调控机制。方法:体外培养HK?2细胞,Western blot及实时定量PCR检测Notch3在顺铂(20 μmol/L,24 h)诱导HK?2细胞凋亡模型及正常细胞中的表达;Targetscan预测靶向Notch3的miRNA,实时定量PCR测定相关miRNA在顺铂诱导HK?2细胞凋亡模型及正常细胞中的表达;然后,将HK?2细胞分别转染阴性对照模拟物(NC mimic)及miR?192?5p模拟物(miR?192?5p mimic),并依据给予或不给予顺铂处理(20 μmol/L,24 h),分为NC mimic组、NC mimic+Cisplatin组、miR?192?5p mimic组、miR?192?5p mimic+Cisplatin组。Western blot及实时定量PCR检测Notch3的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率,研究miR?192?5p对顺铂所致肾小管上皮细胞凋亡及Notch3表达的影响;荧光素酶报告实验证实miR?192?5p与靶基因Notch3的靶向关系。结果:Notch3在顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的表达上调,同时miR?192?5p在顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的表达下调;实时定量PCR证实转染miR?192?5p模拟物后,miR?192?5p的表达量升高;过表达miR?192?5p能够减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡,同时负向调控Notch3的表达;荧光素酶报告实验结果表明miR?192?5p直接靶向作用于Notch3的3′?UTR,抑制Notch3的表达,证实Notch3是miR?192?5p的直接靶标。结论:miR?192?5p可通过直接抑制Notch3的表达而减轻顺铂所致的肾小管上皮细胞凋亡。  相似文献   

7.
目的:构建线粒体靶向过表达ECSIT转基因小鼠,并对其进行鉴定和心功能分析,建立ECSIT基因相关功能研究模型动物。方法:构建过表达打靶载体pCAG?OTCL?ECSIT?3Xflag?BPA,采用电转导方法将线性化打靶载体转入胚胎干细胞(ES细胞);将含有过表达载体的ES细胞进行囊胚腔注射,并将嵌合囊胚移植至代孕小鼠体内,繁殖嵌合体小鼠。嵌合体小鼠和 C57BL/6J 鼠交配繁殖出杂合子,PCR 筛选阳性过表达小鼠。采用小动物超声分析线粒体靶向过表达ECSIT小鼠的心功能。结果:成功构建了线粒体靶向过表达ECSIT载体pCAG?OTCL?ECSIT?3Xflag?BPA,经PCR鉴定为阳性;完成线粒体靶向过表达ECSIT基因打靶及囊胚注射,经PCR鉴定为阳性;分别提取转基因小鼠心肌组织线粒体和胞浆蛋白,检测发现线粒体特异性过表达ECSIT。8周龄转基因小鼠心功能与同龄野生型小鼠无明显差异。结论:成功构建出线粒体靶向过表达ECSIT小鼠;线粒体过表达ECSIT对8周龄小鼠心功能无明显影响。  相似文献   

8.
目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(pCMV?tdTomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。  相似文献   

9.
伍刚 《四川医学》2018,39(5):477-480
摘要:目的乙肝病毒X蛋白(HBx)通过调控宿主细胞蛋白编码基因表达而促进人原发性肝细胞肝癌(肝癌)的发生发展。本研究将HBx的多能调控作用从蛋白编码基因拓展到非编码RNA领域,探讨HBx能否调控肝癌细胞内miRNA表达谱改变。方法构建HBx及质粒空载体稳定转染的Hep G2子代细胞系;利用miRNA芯片及qRT-PCR方法检测HBx在Hep G2细胞中引起的miRNAs表达变化。结果构建了稳定表达HBx的Hep G2-hbx/Hep G2-2.1细胞系以及空载体对照细胞系Hep G2-vc。miRNAs芯片和qRT-PCR证实外源表达的HBx可在Hep G2肝癌细胞中诱发大量miRNA异常表达,大量miRNAs低表达,少数促癌miRNA如miR-21升高。结论 HBx可在体外导致Hep G2细胞内非编码的miRNAs表达谱异常改变。  相似文献   

10.
目的 利用急性肺损伤患者皮肤成纤维细胞构建诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)系.方法 采用慢病毒介导逆转录的方法,将含有Oct4、Sox2、Klf4和Nanog四个因子的混合慢病毒转染人皮肤成纤维细胞,诱导出胚胎干细胞样克隆,根据人胚胎干细胞的特性,利用AP染色、实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术、免疫荧光、畸胎瘤形成实验对获得的iPS细胞进行鉴定.结果 获得的iPS细胞镜下观察呈典型的ES样克隆状生长,圆形或椭圆形,与饲养层细胞分界清楚;AP染色阳性,RT-PCR及免疫荧光检测iPS细胞高表达人胚胎干细胞标志性基因及蛋白,移植到免疫缺陷鼠体内能够形成向三胚层分化的畸胎瘤.结论 成功建立了急性肺损伤患者iPS细胞系,可为急性肺损伤的发病机制研究和临床药物筛选提供良好的细胞模型.  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号