人肝癌细胞系Huh-7中CD133+细胞的分离及鉴定

目的 通过表面标志分选法富集人肝癌Huh-7细胞中CD133+细胞,并初步鉴定其特性.方法 采用流式细胞分选技术从人肝癌细胞系Huh-7中分选出CD133+细胞,并进行干细胞比例分析;通过对CD133+细胞体外成球能力及增殖能力检测,考察CD133+细胞的自我更新能力;观察CD133+细胞在非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)体内的成瘤情况.结果 分选获得的CD133+细胞经无血清培养后阳性比例达90％以上;CD133+细胞体外无血清培养3d即可成球且生长速度较CD133-细胞快;CD133+细胞在NOD/SCID小鼠体内21 d左右即可形成异种移植瘤.结论 CD133+表面标志物分选方法可以高纯度富集CD133+细胞,利用CD133抗体分选获得的CD133+细胞具有肿瘤干细胞样特性.     

CD133~+细胞在结肠癌中的研究进展

<正>大量的研究表明实体瘤中有一小部分肿瘤细胞具有"干细胞"性质[1-2],即所谓的肿瘤起始细胞(tumor initiating cell)或者称肿瘤干细胞(cancerstem cell),其具有无限增殖和自我更新的潜能,能够驱动肿瘤的形成、生长、侵袭、转移,并具有抵抗放化疗的能力[3-4]。有研究证明在很多实体瘤中都存     

胶质瘤中肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定

目的在胶质瘤中分离，培养及鉴定脑肿瘤干细胞，观察脑肿瘤干细胞的生长特性，建立脑肿瘤干细胞分离、培养及鉴定的方法，为脑肿瘤干细胞的进一步研究打下基础。方法术中取胶质瘤细胞，接种于含生长因子的无血清培养基中培养，使其中的脑肿瘤干细胞增殖，并进行有限稀释实验确定肿瘤比例及增值能力；利用细胞免疫荧光及组织免疫组化法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133和Nestin的表达。结果在胶质瘤中，只有大约1％的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，传代后脑肿瘤干细胞仍保持很强的自我更新和增殖能力；体外培养中脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物Nestin和CD133，在肿瘤组织切片中表达CD133阳性细胞。结论胶质瘤组织中存在极少数的脑肿瘤干细胞（大约为1％），并能在体外将其分离，培养；神经干细胞可能是脑肿瘤干细胞的起源细胞。     

对结肠癌中CD133相关基因及通路的生物信息学筛选

目的:寻找与结肠癌干细胞表面标志物CD133表达密切相关的基因及其参与的生物过程。方法:通过生物信息学方法,利用GEO数据库中结肠癌基因芯片数据,结合R2平台,筛选出与CD133表达显著相关的基因,分析相关基因在不同性别、肿瘤原发部位及分期中的表达差异。同时,利用GO及KEGG工具对与CD133表达显著相关基因进行基因本体和KEGG通路分析。结果:130例结肠癌标本中126例检测出CD133表达,与CD133表达显著相关基因共598个(正相关504个,负相关94个),且正负相关性前7位基因的表达与患者性别、肿瘤原发部位及分期无明显关系(P>0.05)。对基因本体及KEGG通路分析后发现,598个相关基因参与O聚糖合成、鞘糖脂合成等多个肿瘤相关生物过程。结论:CD133在结肠癌中普遍表达,CD133表达相关的基因参与了多个肿瘤生物过程,为深入研究结肠癌干细胞分子标志物相关基因及其参与的生物过程提供了一定参考。     

CD133+细胞在局部晚期结肠癌中的异常表达

目的 探讨CD133+肿瘤细胞对结肠癌患者预后的影响。方法 收集有完整随访资料的104例IIIB期(T3-4N1M0)结肠癌根治术后石蜡包埋组织标本及临床资料,采用免疫组化方法检测癌组织及邻近癌旁相对正常组织中CD133抗原的表达情况,分析其与患者临床特征和预后的关系。结果 肿瘤组织中的CD133+肿瘤细胞比较少见而且分布不均匀。CD133染色见于结肠癌细胞膜的腺腔面及基底,在癌巢"出芽"处及有腺管结构的低分化腺癌也可见CD133染色。生存分析显示CD133及T分期都是IIIB结肠癌的独立预后因素。肿瘤组织中CD133+细胞＜5%的患者5年生存率较高（77.4%）,≥ 5％则为45.2%。CD133的表达与其他临床病理参数均无相关性。结论 CD133+肿瘤细胞是IIIB期结肠癌患者5年生存率的独立预后因素, CD133+肿瘤细胞促进了IIIB期结肠癌的进展。     

糖化终末产物对人结肠癌HCT116细胞中ChREBP表达的影响

目的 研究糖化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）对人结肠癌HCT116细胞中碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate responsive element binding protein, ChREBP）表达的影响。方法 采用RT-PCR检测AGEs处理的人结肠癌HCT116细胞中ChREBP及其下游基因的表达;使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预氧化应激状态;运用Western印迹法观察在HCT116细胞中AGEs诱导对ChREBP表达的影响;运用MTS比色法观察AGEs诱导对HCT116细胞增殖的影响。结果 AGEs刺激后人结肠癌HCT116细胞中转录因子ChREBP表达增加（P<0.05）;细胞经抗氧化剂NAC处理后,AGEs刺激所致ChREBP表达增加和HCT116细胞增殖均被明显抑制（P<0.05）。结论 AGEs通过激活氧化应激反应来上调人结肠癌HCT116细胞中的ChREBP表达。     

CD133在人NSCLC组织和细胞系中表达的初步研究

目的观察经典的肿瘤干细胞标记分子CD133在人NCSLC组织和肺癌细胞系中的表达情况。方法用CD133多抗经免疫组化染色观察12例不同类型NSCLC组织中CD133的表达,经免疫荧光染色观察CD133在H446、SPC-A1肺癌细胞中的表达。用AC133单抗经流式和激光共聚焦观察人NSCLC组织、肺癌细胞系中糖基化CD133抗原(AC133抗原)的免疫活性。结果CD133多抗染色发现CD133在NSCLC组织、正常肺组织、H446细胞和SPC-A1细胞中普遍表达。AC133单抗染色发现不同类型NSCLC组织均有少量AC133( )细胞,而在H446、SPC-A1肺癌细胞及正常肺组织中未检测到AC133( )细胞。结论不同类型NSCLC组织中有少量的AC133( )细胞,为深入研究肺癌发生、发展的分子机制提供了新的靶点。     

人卵巢肿瘤细胞系3AO中肿瘤干细胞的分离鉴定

目的利用CD133抗体偶联的免疫磁珠分选法从人卵巢肿瘤3AO细胞系中分离CD133+细胞,并且通过检测其抗凋亡能力和耐药性进一步鉴定其特征。方法通过免疫磁珠分选方法分离人卵巢肿瘤细胞系中CD133+肿瘤干细胞,流式细胞仪检测肿瘤干细胞自我更新能力和抗凋亡能力,裸鼠移植实验反映成瘤性,MTT法检测其耐药性。结果通过免疫磁珠手段可成功分离得到CD133+卵巢肿瘤肿瘤干细胞,细胞增殖活力好,自我更新能力强,随着培养时间的延长可产生大量的CD133-细胞。裸鼠移植成瘤实验表明CD133+细胞成瘤率是10/10,成瘤平均时间是(58±6)d;而CD133-成瘤率是4/10,平均成瘤时间是(145±8)d,CD133+细胞成瘤能力明显强于CD133-细胞。MTT检测结果表明CD133+细胞的IC50值为CD133-细胞的2.5倍左右,提示对顺铂药物不敏感。对使用顺铂的细胞进行吖啶橙染色后发现,大量CD133-细胞呈现细胞凋亡状态,而CD133+细胞形态基本正常。进一步的AnnexinⅤ-FITC和PI双染结果表明,药物处理后的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的抗凋亡能力。结论免疫磁珠分选得到的CD133+细胞具有自我更新、增殖和分化为CD133-细胞等肿瘤干细胞的特征。CD133+细胞比CD133-细胞具有较强的成瘤能力、耐药性及抗凋亡能力。     

JS-K 对人结肠癌细胞HCT116 增殖及凋亡的影响

目的 研究JS-K 对人结肠癌细胞HCT116 增殖及凋亡的影响。方法 不同浓度JS-K 处理 HCT116 细胞48 h 后,采用MTS 法检测JS-K 对HCT116 细胞增殖活性的影响;PI 单染流式细胞术检测 JS-K 对HCT116 细胞周期的影响;Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测JS-K 对HCT116 细胞凋亡的 影响;Texas Red-X 鬼笔环肽荧光染色观察细胞骨架形态;实时荧光定量聚合酶链反应检测Bcl-2 家族基 因mRNA 表达。结果 JS-K 对人结肠癌细胞HCT116 增殖有抑制作用,且呈浓度和时间依赖性（P <0.05）。 JS-K 诱导HCT116 细胞被阻滞在G2/M 期（P <0.05）。JS-K 可致HCT116 细胞发生晚期凋亡（P <0.05）。 JS-K 可改变HCT116 细胞骨架形态、微丝结构与分布。随着JS-K 浓度增加,促凋亡基因Bax、Bik、Bim、 Puma mRNA 相对表达量上调,抗凋亡基因Mcl-1 mRNA 相对表达量下调（P <0.05）。结论 JS-K 对人结肠 癌HCT116 细胞增殖有明显抑制作用,通过调节Bcl-2 家族基因表达,阻滞细胞G2/M 期,促进细胞发生晚 期凋亡。     

沉默CD133基因对CD133+肝癌干细胞放射敏感性的影响

目的 研究沉默CD133基因对人肝癌CD133+-HepG2干细胞放射敏感性的影响.方法 免疫磁珠分选HepG2细胞;流式细胞术检测分选前后CD133表达率;NOD/SCID小鼠成瘤实验验证其干性;靶向沉默CD133基因并分组(空白组、阴性感染组、阳性感染组);RT-PCR和Western blot检测各组CD133基因mRNA和蛋白表达;克隆形成实验检测各组细胞经不同剂量照射后的克隆形成率及存活率,绘制存活曲线并计算各组细胞放射生物学参数Do、Dq、N及放射增敏比(SER);流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡情况.结果 流式细胞术检测结果显示,分选前后CD133表达率分别为(1.36±0.20)％和(87.62±1.92)％.CD133+细胞在细胞数为1×103/ml时即可形成皮下移植瘤.RT-PCR和Western blot检测结果显示,阳性感染组CD133 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制.流式细胞术检测结果显示:阳性感染组G1、S 期减少G2期增加,细胞凋亡率明显增加.克隆形成实验显示阳性感染组D0、Dq、N值与SF2均减小,放射敏感性明显增强,其SER为(1.37±0.02),差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 CD133作为肝癌干细胞的表面标志物之一,可能成为肝癌干细胞放射治疗增敏的靶点.     

HuH7细胞系CD13~+CD133~+HCC细胞分选及CSCs特性分析

目的探讨CD13、CD133双荧光标志流式细胞术(fluorescence activated cell sorter,FACS)分选人肝癌HuH7细胞系CD13+CD133+HCC细胞方法及癌干细胞(cancer stem cells,CSCs)特征。方法 CD13、CD133双标志,采用FACS从人肝癌HuH7细胞系分选出CD13+CD133+HCC、CD13+CD133-HCC、CD13-CD133+HCC、CD13-CD133-HCC等4种细胞亚群;通过CD13+CD133+HCC细胞生长曲线,细胞周期,形成肿瘤球和裸鼠体内成瘤能力,及对5-FU、吡柔比星化疗药物的敏感性研究,分析CD13+CD133+HCC细胞是否具有CSCs生物学特征。结果人肝癌HuH7细胞系CD13+CD133+HCC细胞占23.8%,3.1%分选为CD13+CD133+HCC细胞,78.45%的CD13+CD133+HCC细胞处于G0/G1期;CD13+CD133+HCC细胞增殖明显快于其他3个细胞亚群;在裸鼠103个CD13+CD133+HCC细胞就可以成瘤,而1.0×105个CD13-CD133-HCC只有2只成瘤(2/5),干细胞培养CD13+CD133+HCC细胞8～15 d形成肿瘤球;CD13+CD133+HCC细胞对5-FU和吡柔比星具有抵抗特性,而其他3个亚群较易于杀灭。结论 CD13、CD133双标志FACS从HuH7分选的CD13+CD133+HCC细胞具有CSCs特征,可能成为HCC治疗靶细胞。     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

吲哚美辛对结肠癌细胞HCT116中细胞周期蛋白的影响

目的揭示吲哚美辛抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的分子机理，探讨其抗结肠肿瘤的作用机制。方法不同浓度的吲哚美辛作用于结肠癌细胞株HCT116细胞24h，采用Western蛋白印迹技术检测CDK2、CDK4、Bcl-2、Bax及p21^WAE1/CIP1蛋白表达。结果吲哚美辛能降低CDK2、CDK4及Bcl-2的表达，同时上调p21WAE1／CIP1蛋白的表达且呈剂量依赖方式，而对促凋亡蛋白bax的表达无影响。结论吲哚美辛可通过降低CDK2、CDK4、Bcl-2蛋白，上调p21^WAF1/CIP1蛋白的表达来抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，从而实现其抗肿瘤作用。     

小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定

 目的 明确能否以表面黏附分子CD133为干细胞标志物,使用免疫磁珠分选（magnetic cell separation,MACS）法分离小细胞肺癌细胞系H446细胞中的肿瘤干细胞。方法 以CD133为特异性分子标志物,使用MACS方法分选H446细胞,比较CD133阳性（CD133+）细胞与CD133阴性（CD133-）细胞在集落形成、自我更新、增殖分化、侵袭性、耐药性和成瘤性方面的不同。结果 CD133+细胞和CD133-细胞在集落形成能力、自我更新能力、增殖能力、分化能力、侵袭能力和耐药性方面基本相同。集落形成和成瘤性实验结果显示：CD133+或CD133-细胞中40%以上的细胞都能够形成含有100个细胞以上的大集落,增殖成为与未分选细胞相同的细胞群,并能在裸鼠身上成瘤。结论 表面黏附分子CD133不能作为分选小细胞肺癌H446细胞系中肿瘤干细胞的分子标志物,分选后的CD133+与CD133-细胞中含有相同的肿瘤干细胞。     

昆明山海棠总生物碱对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究昆明山海棠总生物碱(total alkaloids of tripterygium hypoglaucum hutch,THHta)对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用MTT法检测THHta对HCT116细胞增殖的抑制作用;用倒置及荧光显微镜观察THHta作用后HCT116细胞形态的变化;流式细胞术检测THHta对HCT116细胞周期及凋亡的影响,Western bolt检测凋亡相关caspase-3及PARP蛋白表达.结果 THHLa能显著抑制HCT116细胞增殖,抑制率与剂量和时间呈依赖关系.THHta作用HCT116细胞48、72 h的IC_(50)值小于20 μg/ml.THHta(10μg/ml)能诱导HCT116细胞G_0/G_1期比例增加及细胞凋亡,caspase-3活化及PARP蛋白剪切显著增强.结论 THHta能显著抑制HCT116细胞增殖,并可诱导HCT116细胞G_0/G_1期阻滞及细胞凋亡.     

RNAi抑制大肠癌HCT116细胞株VEGF-mRNA表达的实验研究

目的研究载体介导的RNAi(RNA interference) 技术对大肠癌细胞株HCT116中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA表达的抑制作用.方法依据Tuschl等设计siRNA 的原则,以VEGF为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体Pavu6 27中构建重组体 (Pavu6 27-VEGF siRNA).DOTAP脂质体法转染重组体至大肠癌HCT116细胞株,经G418筛选,以空质粒(Pavu6 27)转染为对照;半定量RT-PCR法观察HCT116细胞中VEGF-mRNA表达改变.结果①成功构建发卡样VEGF siRNA(small interfere RNA)真核表达载体(Pavu6 27-VEGF siRNA);② Pavu6 27-VEGF siRNA转染HCT116细胞后,VEGF-mRNA表达较空载体Pavu6 27转染的对照组显著下降.结论成功构建载体介导的VEGF靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制HCT116细胞中VEGF-mRNA表达,为下一步利用RNAi技术抑制肿瘤血管形成以及局部侵袭和远处转移提供研究基础.     

人胎盘CD133^＋、CD133^-细胞组份中高增殖潜能集落形成细胞及其表型特征的初步探讨

目的研究人胎盘CD133^＋、CD133^-细胞亚群中高增殖潜能集落形成细胞（HPP—CFC）频率及表型特征。方法采用机械法制备人胎盘组织（PT）游离细胞悬液,用Histopaque-1077分离出单个核细胞（MNCs）,经磁式分选（MACS）分离纯化CD133^＋和CD133^-细胞。将分选的CD133^＋和CD133^-细胞分别使用H4435培养基培养4wk后观察HPP—CFC集落形成能力,用流式细胞仪（FCM）对分选的细胞组份和HPP—CFC进行表型分析。结果培养4wk后,PT—CD133^＋、CD133^-细胞生成的HPP—CFC集落分别为32．4±11．2／5×10^3,2．0±2．3／5×10^3,前者细胞中HPP—CFC数量明显高于后者（P〈0．01）;PT—CD133^＋、CD133^-细胞培养至28d时CD133^＋CD34^＋,CD133^＋CD34^-和CD133^-CD34^＋亚型均比培养前减少。结论人胎盘组织CD133^＋与CD133^-细胞群中均存在HPP—CFC,但CD133^＋细胞群中的HPP—CFC明显多于CD133^-细胞群,说明胎盘CD133^＋细胞群中存在更多的早期HSPC。     

131I-CD133mAb诱导CD133+HepG2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化

目的 研究131I-CD133mAb可诱导CD133+ HepG2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化(mesenchymal-epithelial transition,MET)及可能分子机制.方法 ①用免疫磁珠分选法分选HepG2人肝癌细胞,采用流式细胞术检测分选前后CD133的表达率,体外成球和体内成瘤实验鉴定其干细胞特性.②氯胺T法制备131I标记CD133mAb并用γ免疫计数器检测标记率、放化纯度.用不同剂量(0、2.4、4.8、9.6 MBq)的131I-CD133mAb作用CD133+ HepG2细胞,用Transwell侵袭实验检测侵袭能力,Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平.结果 流式细胞术显示分选前后CD133 表达率分别为(7.21±0.05)％和(95.26±0.05)％.CD133+细胞体外成球和体内成瘤能力强于CD133-细胞.γ免疫计数器检测131I-CD133抗体标记率为86.97％,放化纯度为98.84％.Transwell侵袭实验示131I-CD133mAb各处理组(2.4、4.8、9.6 MBq)24 h细胞穿过Matrigel胶的细胞分别为(107.7±3.2)、(76.3±2.5)、(44.0±3.0)/视野,显著少于对照组(0 MBq,P＜0.01).Western blot结果显示,与对照组(0 MBq)相比,131I-CD133 mAb(2.4、4.8、9.6 MBq)处理组N-cadherin和Vimentin的蛋白表达量降低(P＜0.01),E-cadherin的蛋白表达量增加(P＜0.01).结论 在体外131I-CD133mAb作用于人肝癌CD133+ HepG2细胞可诱导间质-上皮逆转分化.     

MACS方法分选CD133 /CD44 前列腺癌干细胞的初步鉴定

【摘要】 目的：通过磁珠细胞分选（Magnetic bead cell sorting, MACS）方法从人前列腺癌细胞系PC-3中分选CD133 /CD44 干细胞,为进一步功能性研究奠定基础。方法：运用流式细胞仪检测MACS分选前后PC-3细胞膜上CD133和CD44表达情况;观察无血清培养成球情况,免疫荧光表达情况;比较细胞在分选前后的形态学、增殖能力方面的差异;免疫组化和Western blot检测诱导分化前后PAP蛋白情况。结果：流式细胞术检测PC-3细胞CD133和CD44的阳性表达分别是(1.33?0.05)%和(0.87?0.06)%,而MACS分选后分别为(84.82?0.07)%和(99.91?0.03)%;免疫荧光检测CD133 /CD44 细胞培养后继续呈阳性表达;CD133 /CD44 细胞增殖能力高于PC-3细胞(t=11.0, P=0.008)以及高于诱导后的CD133 /CD44 细胞(t=40.1, P=0.001);CD133 /CD44 细胞经过TGF-β诱导后免疫组化和Western blot检测PAP表达呈阳性,而未诱导的CD133 /CD44 细胞表达呈阴性。结论：MACS从PC-3细胞株中分选的CD133 /CD44 细胞经过初步功能性鉴定具有干细胞的某些特性,可为前列腺癌干细胞的进一步探索充当铺垫。     

Chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in laryngeal carcinoma

Background  Mounting evidence suggests that tumors are histologically heterogeneous and are maintained by a small population of tumor cells termed cancer stem cells. CD133 has been identified as a candidate marker of cancer stem cells in laryngeal carcinoma. This study aimed to analyze the chemoresistance of CD133⁺ cancer stem cells.

Methods  The response of Hep-2 cells to different chemotherapeutic agents was investigated and the expression of CD133 was studied. Fluorescence-activated cell sorting analysis was used to identify CD133, and the CD133⁺ subset of cells was separated and analyzed in colony formation assays, cell invasion assays, chemotherapy resistance studies, and analyzed for the expression of the drug resistance gene ABCG2.

Results  About 1%–2% of Hep-2 cells were CD133⁺ cells, and the CD133⁺ proportion was enriched by chemotherapy. CD133⁺ cancer stem cells exhibited higher potential for clonogenicity and invasion, and were more resistant to chemotherapy. This resistance was correlated with higher expression of ABCG2.

Conclusions  This study suggested that CD133⁺ cancer stem cells are more resistant to chemotherapy. The expression of ABCG2 could be partially responsible for this. Targeting this small population of CD133⁺ cancer stem cells could be a strategy to develop more effective treatments for laryngeal carcinoma.