GIT1蛋白通过调节血管形成促进骨折愈合

目的:探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)在骨折愈合过程中的作用?方法:应用GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只?造模成功后7?14?21 d,应用X线?micro-CT?PECAM1免疫荧光染色等方法分析骨痂体积及新生血管情况?结果:与野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠骨折愈合延迟,骨痂内新生血管的体积和数量减少?结论:GIT1基因缺失导致骨痂区新生血管减少,从而延迟骨折愈合?     

骨折愈合过程中BMP-2和VEGF的表达

目的:观察骨折愈合过程中骨痂组织内骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达及分布情况,并探讨其作用机制。方法:以Wistar大鼠为研究对象,制作股骨骨折愈合模型,采用免疫组织化学和HE染色的方法,检测骨折不同阶段(1,3,7,14,21,28,42d)BMP-2、VEGF的表达、变化和分布。结果:在骨折愈合的不同阶段,骨痂组织内表达BMP-2、VEGF的细胞来源不同,同时表达程度也存在差异。结论:骨折愈合的不同时期,BMP-2、VEGF有着各自的表达和分布特点,并共同调节骨祖细胞的增殖和成骨细胞、软骨细胞的分化,最终完成骨折修复。     

接骨宝对实验性骨折愈合过程中BMP-2表达的影响

目的：通过观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）在骨折愈合过程中的表达及分布情况，探讨接骨宝对实验性骨折愈合过程中BMP-2表达的影响和促进骨折愈合的机制。方法：制作40只兔桡骨骨折模型．随机分为接骨宝组及对照组，术后1d接骨宝组即喂服接骨宝，对照组喂服白开水。分别于术后1、2、3、4、5周取样，随后进行组织学切片及BMP-2免疫组化染色，并采用图像分析系统对BMP-2的表达进行分析。结果：①在骨折愈合过程中。两组在骨痂处的BMP-2含量的总体变化趋势相同，均为早期高后期低，用药组的BMP-2高峰值出现在第2周．对照组出现在第3周；②接骨宝组在整个愈合过程中BMP-2的含量均高于同期的对照组。结论：接骨宝能影响骨折愈合过程中BMP-2的合成、分泌、分布和衰减，进而调节成骨细胞、软骨细胞的分化，促进骨细胞的成熟，增强破骨细胞的活性，加速骨折的修复和塑形，缩短了骨折愈合的进程。     

颅脑损伤对骨折愈合中BMP-2和VEGF表达的影响

目的通过观察大鼠股骨折合并脑外伤时骨痂组织中骨形态发生蛋白2(BMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化,探讨脑外伤对骨折愈合的影响及作用机制。方法取12周雄性SD大鼠16只随机分成二组,每组8只,A组为单纯骨折组,B组为骨折合并脑外伤组。3周后处死所有大鼠,各组摄X线片后截取骨痂,行免疫组织化学染色测定BMP-2、VEGF的表达水平。结果 X线片示A组骨折端有较少量骨痂形成,骨折线较清晰;B组骨折端有较多骨痂形成,骨折线已模糊。免疫组织化学染色见A组BMP-2阳性细胞数量少于B组,并且显色强;分析显示A组BMP-2平均阳性细胞百分数为1.35%±0.29%,B组2.37%±0.46%,A组VEGF平均阳性细胞百分数为0.93%±0.34%,B组1.58%±0.37%,差异均有统计学意义(P<0.05),BMP-2、VEGF的mRNA表达量B组均显著高于A组。结论脑外伤对骨折愈合有促进作用,可能与其刺激BMP-2、VEGF的表达有关。     

枸杞多糖对大鼠骨折愈合过程中BMP-2表达的影响

目的研究枸杞多糖(LBP)对SD大鼠股骨骨折愈合过程中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)表达的影响,探讨枸杞多糖应用于骨折治疗的可能性。方法选用3月龄雄性SD大鼠90只,随机分为三组:LBP高剂量组(H组,160mg.kg-1.d-1)、LBP低剂量组(L组,40mg.kg-1.d-1)、蒸馏水组(W),每组30只。制备右侧股骨干骨折模型,行克氏针髓腔内固定。造模术后分别给药物干预,于术后第2、4、6周每组各取10只大鼠通过免疫组织化学技术检测骨痂组织中BMP-2表达情况,并做相应HE染色,对照观察骨痂组织细胞演变及BMP-2表达变化。结果免疫组化显示各组BMP-2表达在骨折后第2、4、6周均持续升高,各时间点H组表达强度均高于L组和W组,各时间点H组BMP-2表达的MOD值均高于L、W组(P<0.05);与HE染色切片对照观察,各组表达BMP-2阳性细胞种类相同,随骨折愈合进程的增加,BMP-2在成纤维细胞、软骨细胞和骨小梁内的骨细胞表达逐渐减少,在成骨细胞一直呈强阳性表达。组织切片显示H组骨折愈合的组织学演变要早于L组和W组。结论 LBP能够促进骨折愈合过程中BMP-2的表达,存在量-效关系,对骨折愈合有一定的促进作用。     

GIT1-WT及GIT1-Y293F慢病毒载体的构建及其对成骨细胞迁移能力的影响

目的:设计构建G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型(WT)及点突变型(Y293F)慢病毒载体,探讨293位点对GIT1功能的影响?方法:用PCR从小鼠cDNA文库中扩增GIT1-WT,将其连接到慢病毒载体PLJM-GFP中,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-WT,测序鉴定?利用TaKaRa MutanBEST Kit试剂盒,对PLJM-GFP-GIT1-WT进行定点突变,构建质粒PLJM-GFP-GIT1-Y293F,测序鉴定?重组慢病毒载体转染包装细胞293T,获取病毒上清感染培养至第4代的小鼠成骨细胞?划痕愈合试验检测成骨细胞迁移能力的变化?结果:通过PCR鉴定?双酶切鉴定及测序鉴定,成功构建了PLJM-GFP-GIT1-WT与PLJM-GFP-GIT1-Y293F?划痕愈合试验观察,与PLJM-GFP-GIT1-WT相比,PLJM-GFP-GIT1-Y293F明显抑制成骨细胞迁移?结论:GIT1功能的正常发挥有赖于293位点适时的磷酸化?     

梓醇通过上调BMP-2表达激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠股骨骨折愈合

目的:探讨梓醇对大鼠股骨骨折愈合的作用及其可能的作用机制.方法:将48只SD股骨骨折模型大鼠随机分为对照组、梓醇组、梓醇+sh-NC组和梓醇+sh-BMP-2组,每组12只.梓醇组大鼠灌胃50 mg/kg梓醇,梓醇+sh-NC组大鼠灌胃50 mg/kg梓醇和尾静脉注射300 μL sh-NC慢病毒液,梓醇+sh-BMP...     

GIT1发夹结构干扰MLC的分布及其磷酸化

目的:探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein1,GIT1)的RNA发夹结构(hairpin)(GIT1-RNAh)对成骨细胞内肌球蛋白轻链(myosinlightchain,MLC)的分布及磷酸化的影响,并分析其机制。方法:取培养至第6代的鼠成骨细胞,随机分成两组,分别用包含GIT1-RNAh(实验组)和绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的发夹结构(GFP-RNAh)的腺病毒(对照组)感染12h,再将每组分成有、无血小板衍生生长因子(platelet-drived growth factor,PDGF)刺激的两组,免疫荧光染色方法检测成骨细胞内MLC的位置,Western blot检测MLC的磷酸化。结果:免疫组织化学观察:和对照组相比,实验组明显扰乱了成骨细胞MLC的分布;Western blot观察:和对照组相比,实验组明显抑制了MLC的磷酸化(P<0.05)。结论:GIT1的发卡结构过表达可干扰MLC的分布和其磷酸化。     

雷奈酸锶对骨质疏松大鼠骨折愈合过程中BMP-2表达的影响

目的 探讨雷奈酸锶对骨质疏松大鼠股骨折愈合的治疗效果及其作用机制.方法 雌性3月龄SD大鼠36只,随机分为三组:正常骨折组(A),骨质疏松性骨折组(B)、雷奈酸锶干预组(C),每组各12只.B、C组接受双侧卵巢切除术,A组行假手术,术后8周,所有大鼠于行骨密度检测确认骨质疏松模型建立成功后,制作股骨中段骨折模型,克氏针固定,C组给予雷奈酸锶干预(1g/kg/day).骨折6周后取材,每组半数标本骨痴组织研磨提取RNA,Realtime PCR法检测BMP-2 mRNA的表达,另半数标本常规脱钙、石蜡包埋,HE染色观察骨折愈合情况,免疫组织化学染色观察BMP-2蛋白的表达.结果 HE染色结果:A组大鼠骨痂组织较成熟,部分标本可见板层骨形成,B组大鼠骨折愈合进程较正常延迟,软骨性骨痂成分居多,C组优于B组,但仍较A组延迟;Realtime PCR及免疫组化提示C组BMP-2表达显著高于A、B组;A、B组间BMP-2表达水平差异无统计学意义.结论 骨质疏松大鼠较正常大鼠骨折愈合进程延迟,雷奈酸锶可促进骨质疏松性大鼠骨折愈合,其机制可能与上调BMP-2的表达有关.     

成骨因子 BMP-2/Smads/Runx2信号转导通路

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-2在骨形成过程中起着重要作用, BMP-2与多种细胞因子形成信号通路,促进成骨性细胞分化和骨细胞外基质合成与分泌。在骨形成过程中, BMP-2也作为启动调节因子促进新骨形成。该文就骨形态发生蛋白重要信号通路 BMP-2/ Smads/ Runx2与骨发生发育的研究进展作一综述。     

BMP2mRNA在骨折愈合过程中的表达及意义

目的：探讨骨形成蛋白（ＢＭＰ）在骨诱导过程中的作用机理．方法：建立骨折愈合模型，利用原位杂交方法检测骨折愈合过程中ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的表达．结果：骨折后第５日间充质细胞、成骨细胞内均见阳性信号，第７日开始信号明显增强，软骨细胞内也可见阳性信号，第１４日后信号逐渐减弱．结论：在成骨活动活跃时，间充质细胞、成骨细胞、软骨细胞均有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录，然后编码形成ＢＭＰ２蛋白来促进及调节骨折的修复．     

骨折愈合过程中骨形态发生蛋白1,2,3基因的动态表达

目的　通过观察骨折愈合过程中三种 BMP(1,2 ,3)基因表达量的动态变化 ,明确此三种 BMP是否参与正常骨折愈合过程 ,以及作用时限 .方法　将 48只新西兰兔左前肢桡骨中段制成骨折模型 ,术后随机分为 6个时间组 ,分别于术后1,2 ,3,4,6 ,8wk在骨折处取材 ,分别用 BMP1,2 ,3c DNA作探针进行打点杂交 ,检测 BMP(1,2 ,3) m RNA的表达水平 ,对侧正常桡骨中段作为对照 .结果　 BMP 1,2 ,3三种基因在骨折愈合早期的表达均明显增高 ,峰值位于术后 2 wk,表达量分别为 191,2 85 ,2 13ng· g- 1 ,而正常对照侧分别为 32 ,6 5 ,6 0 ng· g- 1 .结论　 BMP 1,2 ,3均参与骨折的修复过程 ,主要在愈合早期发挥作用     

低强度脉冲超声对兔桡骨骨折愈合及小窝蛋白-1基因表达的影响

 目的 探讨低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS)对长管状骨骨折愈合的作用,测定LIPUS作用下兔桡骨骨折部位小窝蛋白-1(caveolin-1)局部表达情况。方法 在24只新西兰白兔双侧桡骨中下1/3处制作宽为3 mm的骨缺损模型,按随机数字表法平均分为4组(n=6)。右侧桡骨骨折处给予强度为30 mW /cm2的LIPUS刺激,每天1次,每次20 min,左侧桡骨骨折处给予切断电源的假刺激。各组实验动物分别于术后第7、14、21、28天,采用X 线片、HE染色评价骨折愈合情况,免疫组化染色检测小窝蛋白-1水平与定位,实时荧光定量PCR检测小窝蛋白-1、软骨和骨特异基因Col2a1、Col10a1及骨钙蛋白(osteocalcin)的mRNA水平。结果 自第14天起,实验侧X线评分和矿化骨痂面积均显著大于对照侧,二者随治疗时间的延长而逐渐增高;HE染色提示实验侧软骨细胞分化、凋亡,形成原始骨小梁和骨小梁的融合等过程均早于对照侧。免疫组化染色显示术后第7、14天,随着软骨细胞的增殖、分化,小窝蛋白-1水平逐渐增加,实验侧显著大于对照侧;第21、28天,迁移至软骨基质表面的间充质细胞开始向成骨细胞分化,小窝蛋白-1水平降低,实验侧显著低于对照侧。实时荧光定量PCR结果显示:实验侧小窝蛋白-1mRNA水平在第7天显著高于对照侧,在第21天却显著低于对照侧;实验侧Col2a1,Col10a1及骨钙蛋白mRNA水平在第7、14天显著高于对照侧,在第21天却显著低于对照侧,在第28天实验侧Col2a1和骨钙蛋白mRNA水平显著低于对照侧。结论 LIPUS可通过促进软骨内成骨加速长管状骨骨折愈合,推测可能与先上调软骨细胞,随后下调间充质细胞小窝蛋白-1的表达有关。     

丹芍化纤胶囊通过上调ALK2、p-Smad1/5/8改善四氯化碳所致大鼠肝纤维化

目的 观察丹芍化纤胶囊(DSHX)对四氯化碳(CCl4)所致肝纤维化大鼠肝脏骨形态发生蛋白Ⅰ型受体(BMPR-Ⅰ)中的激活素受体样激酶2(ALK2)、磷酸化Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)与DNA结合(分化)抑制因子2(Id2)表达的影响,探讨该药治疗肝纤维化的可能机制.方法 雄性Wistar大鼠50只分为对照组(A组)、肝纤维化模型组(B组)、自然恢复组(C组)、DSHX低剂量治疗组(D组)、DSHX高剂量治疗组(E),每组10只.除A组外,其余各组用CC14复合因素复制大鼠肝纤维化模型,共8周.D、E组分别用0.5、1.0 g/kg DSHX灌胃8周,1次/日.实验结束后分别采用酶联免疫吸附试验测定大鼠肝匀浆透明质酸(HA)、羟脯氨酸(Hyp)水平,Masson染色法观察肝组织内胶原纤维沉积程度,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝组织ALK2、Id2 mRNA水平,蛋白质印迹法(Western blotting)分析肝组织ALK2、Id2及p-Smad1/5/8蛋白的表达.结果 B组肝匀浆HA、Hyp水平高于A组(P＜0.01),肝组织ALK2、Id2 mRNA和蛋白的表达及p-Smad1/5/8蛋白表达均低于A组(P＜0.01);D、E组大鼠肝纤维化程度较B组和C组明显改善,肝匀浆HA、Hyp水平均低于B组和C组(P＜0.01),肝组织ALK2 mR-NA和蛋白及p-Smad1/5/8蛋白表达均高于B组和C组(P＜0.01),肝组织Id2 mRNA的表达高于B组和C组(P＜0.01),但Id2蛋白表达与B组、C组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 DSHX对大鼠肝纤维化的治疗作用机制可能与上调ALK2、p-Smad1/5/8的表达有关.     

骨折延迟愈合患者外周血骨形态发生蛋白-2水平的检测

目的:探讨骨折延迟愈合患者外周血骨形态发生蛋白-2(BMP-2)水平的变化与其临床特征之间的关系。方法:73例骨折患者应用ELISA方法对其骨折后l、2、4、8、12、24、36、48、60周进行外周血的BMP-2检测,检测结果按照骨折延期愈合与正常愈合,延期愈合组中又按照骨折部位、对常规治疗的反应效果进一步分组,统计这些组别外周血中BMP-2的不同表达水平。结果:骨延迟愈合患者外周血BMP-2在创伤后第一周内迅速升高,第2周内迅速回落,而后维持在比正常人群还低的水平;骨正常愈合患者中第1~2周缓慢升高,至第8周才开始回落。将骨延迟愈合患者细分化后发现四肢骨近端部位外周血BMP-2表达规律接近于总骨延迟愈合患者外周血BMP-2随时间表达规律。而四肢骨远端包括掌指骨外周血BMP-2在骨折后一直未见增高。常规治疗48周后临床愈合的患者其外周血BMP-2时间表达规律与正常对照组相似,而有效和无效组外周血BMP-2时间表达规律则与总骨延迟愈合患者外周血BMP-2时间表达规律。结论:骨折后外周血中BMP-2表达水平与骨折愈合情况及骨折部位有关。     

苏氏接骨胶囊对胫骨干骨折大鼠模型促早期愈合作用及BMP-2表达的影响

[目的]探讨苏氏接骨胶囊（简称Su）对大鼠胫骨干骨折早期愈合的促进作用及骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达的影响。[方法]36只6周龄雄性SD大鼠按照随机数字表分为假干预组、Su剂量140 mg/（kg·d）组（Su-140组）和Su剂量280 mg/（kg·d）组（Su-280组）。分组建立胫骨干闭合骨折髓内钉固定模型,术后第2天开始给予相应的药物干预。造模后10 d,过度麻醉心脏取血并处死各组大鼠。对大鼠患肢胫骨进行取材后,通过X线对骨折愈合情况进行初步检查;通过Micro-CT技术计算骨痂的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）,并对骨痂进行组织形态学观察;通过免疫组化技术观察骨痂中BMP-2的表达,实时荧光聚合酶链反应（Real Time-PCR）定量检测血清BMP-2的含量。[结果]骨折造模术后10 d,假干预组、Su-140组及Su-280组3组大鼠的骨折断端均可见骨痂形成,骨折端愈合尚稳定,部分标本骨折断端稍有微动。经X线观察Su-280组骨折端愈合情况好于Su-140组及假干预组,Su-140组优于假干预组。Micro-CT检测结果提示,Su-140组和Su-280组的BV/TV值均高于假干预组,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。Tb.Th和Tb.N 2个参数,Su-140组与假干预组间比较无统计学意义（P>0.05）,Su-280组与假干预组间比较有统计学差异（P<0.01）,Su-140组与Su-280组间比较有统计学差异（P<0.01或P<0.05）。免疫组化结果显示,Su-280组骨痂内有大面积的BMP-2表达区域,Su-140的表达区域较少,假干预组更少;RealTime-PCR结果显示,3组间BMP-2的含量差异存在显著性（P<0.05）,其中Su-280组与Su-140组和假干预组差异均有显著性（P<0.05）,Su-140组和假干预组间差异无显著性（P>0.05）。[结论]苏氏接骨胶囊能促进大鼠胫骨干骨折的早期愈合及BMP-2的表达,且随药物浓度的增加,骨折愈合越快,其机制可能为Su促进BMP-2的表达,进而诱导成骨细胞及胞外基质的分化增殖,促进骨形成及骨愈合。     

骨折愈合过程中低氧诱导因子-1α的表达及其调节作用

目的 探讨骨折愈合过程中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及其调节作用.方法 建立小鼠胫骨骨折模型,骨折后1、3、7、14、21、28 d取材,应用X线摄片、Micro-CT和四环素荧光双标记技术,观测骨痂组织的演变和新骨形成状况;采用RT-PCR、Western blotting和免疫组织化学方法 ,检测骨痂组织细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)和成骨性标志物(Runx2和ALP)的表达状况,分析HIF-1α与骨折愈合进程的关系.结果 在早期骨痂组织中,募集于骨折处的细胞以及由此演化的成骨细胞、软骨细胞及骨细胞在低氧环境中均表达HIF-1α.骨折后第7天,HIF-1α阳性细胞百分率达到峰值,持续高表达7 d后逐渐下降,骨折后第28天基本恢复至骨折前水平;细胞VEGF表达特征的变化与HIF-1α的表现相似;早期骨痂细胞的骨形成功能活跃,骨痂体积较大,至骨折后14 d达到峰值后随骨改建的发生而逐步减小,骨痂矿化沉积主要发生于骨折愈合的中晚期(14～28 d).结论 骨折愈合过程中,参与骨折愈合的细胞属低氧感应细胞并表达HIF-1α;HIF-1α可调节细胞自身的状态,通过调控早期骨痂细胞的功能和刺激血管新生而参与调节骨折的愈合.     

骨多形性蛋白2cDNA在COS细胞和B16F1细胞中的表达差异

目的研究骨多形性蛋白2cDNA（BMP2cDNA）转染入COS细胞和B16F1细胞中的表达差异。方法BMP-2cDNA克隆在AD1—1载体中巨细胞病毒的早期启动子下游，构建了表达质粒BMP-2／AD1—1。采用脂质体法将表达质粒分别转染入COS细胞和B16F1细胞中。72h后，分别取100μL培养上清进行Western印迹，检测所表达的BMP-2蛋白。结果Western印迹结果显示：BMP-2／Ad1-1转染的COS细胞上清液中有2条BMP-2特异表达带，大小约为39kD和36kD；BMP2／Ad1-1转染B16F1细胞上清液中有1条特异表达带，大小约为15kD。结论BMP-2cDNA在COS细胞和B16F1细胞中表达产物的种类与大小均有差异。     

BMP2诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化的分子机制研究

目的：探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）诱导鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1／2向成软骨分化的可能分子机制。方法：20μg／mLBMP2诱导C3H10TI／2细胞0,4h,1,3,6,10,13,15d后,RT—PCR检测BMP信号通路中关键分子BMPRI,BMPRII,Smadl／5／8的表达,Westernblot检测smad蛋白及MAPK信号通路中p38磷酸化水平变化,QRT—PCR检测成软骨标志基因aggrecan,Col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平,同时用Alcine Blue染色,观测C3H10T1／2细胞成软骨分化情况。结果：经BMP2诱导后,C3H10T1／2细胞表现出成软骨分化,smad蛋白及p38磷酸化水平有所上升,同时成软骨标志基因col2a1以及成软骨相关转录因子FGFR3,Sox9表达水平都有增加。与未诱导组相比,Col2a1,FGFR3,Sox9在3d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）,FGFR3,Sox9在6d的表达与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：在一定培养条件下,BMP2具有诱导C3H10T1／2细胞成软骨分化能力。