PLGA材料应用于组织工程血管的初步研究

目的探讨PLGA材料应用于组织工程血管的可行性。方法应用胎儿脐血管和平滑肌细胞，内皮细胞种植于PLGA血管片上并进行培育，应用光镜与电镜观察细胞生长情况并采用放免方法测定内皮细胞功能状况。同时把血管片包埋于小鼠皮下，观察血管钙化与组织相容性情况。结果顺序培育4周后，平滑肌细胞，内皮细胞在PLGA血管片上贴附良好，血管片结构与正常血管相一致；并且细胞种类可通过免疫组化方法鉴定，平滑肌细胞多层排列，而内皮细胞层为单层。同时在血管片培养液中可检测出内皮素和6-酮-前列腺素。包埋实验显示在各个观察时间点血管片无钙化，并且组织相容性较好。结论采用PLGA血管片做细胞支架，平滑肌细胞，内皮细胞在血管片上贴附和生长良好，且内皮细胞还能合成分泌血管活性物质。同时具有良好的组织相容性。该结果说明在PLGA血管片上顺序接种上平滑肌细胞和内皮细胞可开发出具有一定形态和功能特征的组织工程血管片。具有用作组织工程血管的潜能。     

聚乙交酯-聚丙交酯降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管

目的：探讨改良聚乙交酯-聚丙交酯（PLGA）降解支架复合胎儿脐动脉细胞方法构建组织工程血管（TEBV）的可行性。方法：将胎儿脐动脉的平滑肌细胞,内皮细胞种植于国产PLGA血管上并进行培育,观察两种细胞生长情况、检测内皮细胞、平滑肌细胞并测定其功能。结果：培育2mo后,平滑肌细胞,内皮细胞在PLGA血管片上黏附良好,材料组织相容性好。结论：应用PLGA降解支架复合胎儿脐动脉细胞构建组织工程血管的体外培养方法是可行的,PLGA支架有利于细胞生长、分化及功能发挥,动态培养方法培养出的TEBV色泽光亮,厚度均匀,具有良好的弹性。     

胚胎干细胞构建小口径组织工程血管的研究

目的通过小鼠胚胎干细胞定向分化出的内皮细胞和平滑肌细胞构建组织工程小口径血管。方法将小鼠胚胎干细胞诱导分化出的内皮细胞和平滑肌细胞分别种植于管状聚乳酸-羟基乙酸（polylactic glycolic acid，PLGA）管腔内面，构建出小口径组织工程血管，再将其移植入裸鼠皮下，每隔1周取1次包埋的小口径组织工程血管，共取3次；再行HE染色，免疫组化行内皮细胞、平滑肌细胞鉴定，并且在倒置相差显微镜下观察其形态。结果倒置相差显微镜下观察结果显示小鼠胚胎干细胞诱导分化出的平滑肌细胞呈长梭形，而内皮细胞呈“鹅卵石”样；HE染色显示平滑肌、内皮细胞在PLGA表面上延伸生长；动物体内移植实验结果显示，管状PLGA皮下小口径组织工程血管移植后逐渐降解、直至变薄中断，免疫组织化学和HE染色显示管腔内的血管平滑肌样细胞和内皮样细胞在PLGA上呈片状融合生长，并见大量的细胞外基质。结论胚胎干细胞诱导的平滑肌和内皮细胞与PLGA有良好亲和性，可以用胚胎干细胞与PLGA制作小口径组织工程血管。     

不同雌激素水平对大鼠血管内皮细胞功能及血管内皮细胞粘附分子1表达的作用

目的研究雌激素对雌鼠肺血管内皮细胞功能及血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)表达的调节。方法（1）雌性SD大鼠24只分为假手术组、去势组、治疗组,采用放射免疫法检测血清中内皮素、前列环素的含量,铜-镉还原法测定血清中一氧化氮的产量。放射配体结合法检测肺血管内皮细胞中雌激素受体含量。（2）正常雌鼠肺培养的第2代血管内皮细胞,按不同浓度17-β雌二醇(17-βE2)分为A组（对照）、B组（3×10-8mol/L17-βE2）、C组（3×10-7mol/L17-βE2）;D组（3×10-6mol/L17-βE2）、E组（3×10-6mol/L17-βE2+3×10-6mol/L他莫西芬）处理48h,白细胞介素-1β作用后流式细胞仪分别检测各组VCAM-1表达量。结果(1)去势组雌鼠血中一氧化氮（18μmol/L±8μmol/L）、前列环素（8.5pg/ml±2.5pg/ml）均降低,治疗组二者水平明显升高（31μmol/L±7μmol/L,P<0.05;10.9pg/ml±3.4pg/ml）,而内皮素含量变化则相反（170pg/ml±39pg/ml;100pg/ml±32pg/ml,P<0.05）。(2)去势组雌鼠血管内皮细胞中雌激素受体含量(fmol/106cell）显著降低（6.7±0.5),治疗组雌激素受体含量维持在高水平（17.6±1.2,P<0.01）。(3)白细胞介素-1β作用后A组表达VCAM-1细胞百分率明显增高（17.5%±1.5%）,B、C、D组表达VCAM-1细胞百分率显著降低（15.4%±1.42%、12.4%±0.34%、8.7%±0.27%,P<0.01）。结论雌激素水平可明显影响雌鼠血管内皮细胞内皮素、一氧化氮、前列环素的分泌,并可影响雌鼠血管内皮细胞中雌激素受体含量。雌二醇均可降低白细胞介素-1β诱发的雌鼠血管内皮细胞VCAM-1表达增高。     

再造组织工程化平滑肌组织的实验研究

目的采用组织工程技术,将培养扩增的膀胱平滑肌细胞与国产可降解的聚合聚乙交酯丙交酯（PLGA）支架材料复合构建并植入裸鼠体内进行培育,探讨再造组织工程化平滑肌组织的可行性。方法从幼兔取膀胱,机械分离与酶消化获取培养平滑肌细胞,传代扩增平滑肌细胞后将其接种到国产PLGA支架材料的表面作为实验组,未接种细胞的单纯支架材料作为对照组。分别将它们植入到裸鼠体内进行培育。经裸鼠体内培育4周、8周后取材并进行大体观察、组织学及免疫组织化学检测。结果实验组标本经HE和Masson染色显示在材料表面形成数层平滑肌细胞层,经抗平滑肌α-肌动蛋白免疫组织化学染色呈棕黄色阳性。随着培育时间的延长,支架材料降解明显,而平滑肌细胞层进一步增殖形成平滑肌组织。对照组经HE染色材料表面见有少量成纤维细胞沉积,Masson染色示兰色,经抗平滑肌α-肌动蛋白免疫组织化学染色为阴性。结论采用国产PLGA聚合物为支架材料可再造出组织工程化平滑肌组织,为多种含平滑肌组织空腔脏器的组织工程研究奠定基础。     

脂肪干细胞复合PLGA体外诱导成软骨的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞接种于PLGA支架复合培养体外诱导成软骨的能力.方法 收集脂肪干细胞,调整细胞悬液密度为4.0×1010>/L,接种在PLGA支架材料上进行复合,在特定培养基条件下,对脂肪干细胞/PLGA进行成软骨诱导,于诱导3周后应用扫描电镜观察,藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞接种子PLGA材料后,复合体表面逐渐光滑润泽,质地逐步增韧,体外诱导后细胞/PLGA支架复合体基本保持原状;3周时取材行扫描电镜观察,可见细胞在材料表面附着生长,基质分泌明显,连串成片;石蜡切片藩红O/固绿染色可见诱导组细胞胞外基质分泌旺盛,和支架材料连接成片,呈强阳性红染;胞外基质Ⅱ型胶原免疫组织化学着色阳性;RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均阳性表达.结论 脂肪干细胞能够和PLGA复合培养,在特定诱导培养基条件下可以向软骨方向分化,形成类软骨样组织.     

旋转式生物反应器内构建组织工程髓核

目的 探讨旋转式生物反应器(RCCS)对体外构建的组织工程髓核的影响.方法 将兔髓核细胞体外扩增至第3代,以3×107/ml的浓度接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)无纺网支架上.实验组在RCCS内培养,对照组静态培养.培养4周后取出细胞与支架复合物,行大体标本观察、扫描电镜、组织学和免疫组织化学染色观察、定量测定糖胺聚糖(GAG)及DNA含量.结果 旋转式生物反应器下构建的组织工程髓核的厚度、大小及组织弹性好于对照组,实验组GAG、DNA含量分别为(211.0±10.9,13.3±2.1),Ⅱ型胶原免疫组织化学染色面积百分比明显高于对照组(152.0±14.4,7.5±1.5),差异有统计学意义(P<0.05).结论 旋转式生物反应器能促进椎间盘髓核细胞Ⅱ胶原及糖胺聚糖的合成分泌,有利于在体外构建组织工程髓核.     

利用PLGA细胞支架再生人关节软骨的实验研究

目的：研究人关节软骨细胞在PLCA三维支架上的贴附和生长情况，利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法：制作PLGA三维细胞支架。分离培养成人关节软骨细胞，体外扩增后种植到PLGA支架中。在体外和裸鼠体内分别培养软骨细胞一支架复合物，分期终止培养，进行组织学染色、扫描电镜、Ⅱ型胶原免疫组织化学及cDNA探针原位杂交检测。结果：体外培养发现，软骨细胞支架材料内贴附生长良好，长期培养仍保持软骨细胞特性，棵鼠体内培养8周后可形成软骨样组织。结论：PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌软骨外基质，可作为软骨组织工程的细胞载体。利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化关节软骨。     

重度子痫前期患者的血清作用下NK细胞对血管内皮细胞分泌内皮素-1及前列环素的影响

目的 研究在重度子痫前期患者的血清作用下,NK细胞对血管内皮细胞分泌内皮素-1(ET-1)及前列环素的影响.方法 重度子痫前期组、正常妊娠组各18例,采用1∶1配比的病历对照研究.用20％重度子痫前期及正常妊娠妇女的血清孵育NK细胞,加入脐带血管内皮细胞(HUVEC)培养体系中培养24 h.采用放射免疫方法检测NK细胞与HUVEC培养上清液中ET-1及前列环素的稳定代谢产物6-keto-PGF1α的水平.结果 重度子痫前期组血管内皮细胞分泌ET-1的水平为(40.35±8.94)pg/mL,与正常妊娠组(33.06±7.88)pg/mL相比显著增高(P＜0.01),差异具有统计学意义;重度子痫前期组血管内皮细胞分泌6-ke-to-PGF1α的水平为(527.23±102.59)pg/mL,与正常妊娠组(629.64±114.45)pg/mL相比显著降低(P＜0.01),差异具有统计学意义.结论 在重度子痫前期患者的血清作用下,NK细胞导致血管内皮细胞分泌血管收缩因子内皮素-1增多,分泌血管舒张因子前列环素减少.     

三种人工合成可降解血管支架材料体外生物相容性及表面改性研究

目的:对聚对苯二甲酸丁二醇酯-co-聚对苯二甲酸环己烷二甲醇酯-b-聚乙二醇嵌段共聚物(T20)、聚3羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)和聚对苯二甲酸丁二醇酯/聚乙二醇对苯二甲酸酯嵌段共聚物(PEGT/PBT)共三种人工合成的可降解血管支架材料进行体外生物相容性评价,并观察它们表面改性后对犬血管平滑肌细胞黏附生长的影响.方法:通过测定接触角观察三种支架材料的亲水性;MTT法、流式细胞术(FITC)及扫描电镜观察犬血管平滑肌细胞在T20、PHBV和PEGT/PBT三种支架上的增殖及生长情况,评价它们的体外生物相容性;采用明胶及多聚赖氨酸对三者进行表面预处理,MTT法比较三者表面改性后犬血管平滑肌细胞的黏附生长情况.结果:三种材料的接触角均小于90°,亲水性的大小顺序为:PEGT/PBT＞T20＞PHBV.MTT法显示犬血管平滑肌细胞可以在PHBV、PEGT/PBT、F20支架材料上黏附生长,接种24 h后细胞活性升高(PEGT/PBT＞T20＞PHBV,P＜0.01),随后降低,72 h后又开始增高(T20＞PEGT/PBT＞PHBV,P＜0.01);FITC荧光染色可见犬血管平滑肌细胞在载体上成片生长,状态良好;扫描电镜见犬血管平滑肌细胞在载体上呈片状融合生长,并见大量的细胞外基质.MTT法结果表明三种材料经过明胶或多聚赖氨酸表面改性预处理后细胞增殖活性明显高于未处理组(P＜0.01).结论:T20、PHBV、PEGT/PBT血管支架材料具有良好的体外生物相容性,对其进行表面改性后可明显提高犬血管平滑肌细胞的黏附生长能力.     

Human vascular smooth muscle cells and endothelial cells cocultured on polyglycolic acid (70/30) scaffold in tissue engineered vascular graft

Background Current prosthetic, small diameter vascular grafts showing poor long term patency rates have led to the pursuit of other biological materials. Biomaterials that successfully integrate into surrounding tissue should match not only the mechanical properties of tissues, but also topography. Polyglycolic acid (70/30) has been used as synthetic grafts to determine whether human vascular smooth muscle cells and endothelial cells attach, survive and secrete endothelin and 6-keto-prostaglandin F1α (6-keto-PGF1α).Methods Endothelial cells and smooth muscle cells were isolated from adult human great saphenous vein. They were seeded on polyglycolic acid scaffold in vitro separately to grow vascular patch (Groups A and B respectively) and cocultured in vitro to grow into vascular patch (Group C). Smooth muscle cells and endothelial cells were identified by immunohistochemical analysis and growth of cells on polyglycolic acid was investigated using scanning electron microscopy. The levels of endothelin and 6-keto-PGF1α in the culturing solutions were examined by radioimmunology to measure endothelial function. Results Seed smooth muscle cells adhered to polyglycolic acid scaffold and over 28 days grew in the interstices to form a uniform cell distribution throughout the scaffold. Then seed endothelial cells formed a complete endothelial layer on the smooth muscle cells. The levels of endothelin and 6-keto-prostaglandin F1 alpha in the culturing solution were (234±29) pg/ml and (428±98) pg/ml respectively in Group C and (196±30) pg/ml and (346±120) pg/ml in Group B; both significantly higher than in Groups A and D (blank control group, all P&lt;0.05 ). Conclusions Cells could be grown successfully on polyglycolic acid and retain functions of secretion. Our next step is to use human saphenous vein smooth muscle cells and endothelial cells to grow tubular vascular grafts in vitro.     

大鼠胃平滑肌细胞的体外分离与三维支架培养方法

目的:探讨复合胶原酶和胰蛋白酶解离大鼠胃平滑肌细胞,建立稳定的胃平滑肌细胞体外培养模型,并探讨其三维复合培养的可行性。方法:0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰蛋白酶酶解大鼠胃平滑肌,用相差显微镜观察细胞学形态与生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞;采用纤维蛋白胶作为细胞外基质建立三维PLGA复合物培养模型,荧光显微镜观察复合物中的细胞活性。结果:平滑肌组织裂解充分均匀,细胞接种成功率高,1～2周细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长;α-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色证实所获得的平滑肌细胞,荧光显微镜下观察到PLGA支架内细胞均匀分布,存活率达90%以上。结论:酶解分离法可获得高纯度大鼠胃平滑肌细胞,三维支架培养在体外成功培养胃平滑肌细胞复合物,为深入研究胃组织工程再生奠定了基础。     

应用骨髓干细胞和自制胶原-壳聚糖构建组织工程心瓣膜

目的探讨应用骨髓基质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化的内皮细胞为种子细胞,以胶原-壳聚糖复合物为支架材料,运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的可行性。方法兔主动脉壁体外分离、培养、传代平滑肌细胞、成纤维细胞,将培养的成纤维细胞、平滑肌细胞与兔骨髓基质干细胞诱导分化的内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上,通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞在支架上生长、增殖和基质分泌情况。结果 HE染色示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架黏附、伸展、增殖,在TEHV表面长成连续的细胞层;扫描电子显微镜示TEHV表面光滑,细胞生长良好,细胞层完整,且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素(PGI2)的功能。结论以兔主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌细胞、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞,依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV,且内皮细胞能够分泌PGI2。     

血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

目的:观察血小板衍生生长因子-BB对培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞胶原蛋白合成的影响.方法:采用培养的人血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞,应用3H-脯氨酸掺入方法,观察血小板衍生生长因子-BB对3种细胞胶原蛋白合成的影响.结果:血小板衍生生长因子-BB可促进处于静止状态的成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成,并呈现出明显的浓度依赖关系,成纤维细胞和平滑肌细胞胶原蛋白合成分别在30 ng/ml和40 ng/ml时达到高峰,血小板衍生生长因子-BB对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.在30 ng/ml的血小板衍生生长因子-BB作用下,成纤维细胞和平滑肌细胞分别在36 h和48 h时胶原蛋白合成达到高峰.结论:血小板衍生生长因子-BB可明显促进培养的人血管平滑肌细胞和成纤维细胞的胶原蛋白的合成,对血管内皮细胞胶原蛋白合成总量无明显促进作用.     

骨髓间质干细胞和脱细胞基质构建组织工程血管的动物实验

目的以骨髓细胞作为种子细胞,血管脱细胞组织基质作为支架、构建组织工程血管。方法分离小猪骨髓单个核细胞,分别置于内皮细胞培养液和平滑肌细胞培养液中培养,观察分化细胞的抗原标志;多步骤法制备犬血管脱细胞组织基质,将未经分化的骨髓单个核细胞种植于脱细胞基质构建组织工程血管,移植至骨髓供体小猪,代替部分肺动脉血管。结果小猪骨髓细胞经内皮细胞培养液或平滑肌细胞培养液培养后,分别出现成熟内皮细胞或平滑肌细胞的形态学改变,并分别表达内皮细胞或平滑肌细胞的特异性抗原;组织工程血管移植100d后管腔通畅,无血栓、钙化或动脉瘤形成,内皮细胞和平滑肌细胞分化、增殖良好;移植血管的最大负载为2．76N,最大伸长度为20．31mm。结论骨髓单个核细胞复合脱细胞基质可成功构建组织工程血管。     

具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架的制备

目的制备具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架材料，为构建组织工程血管奠定基础。方法用含有脱氧胆酸钠、SDS、EDTA的低渗液和等渗液以及核酸酶对猪的胸主动脉进行脱细胞处理．使用HE、Movat五色法、DAPI染色及电镜观察处理结果。以MTT法分析脱细胞溶液的细胞毒性，通过种植内皮和平滑肌细胞，分析支架的细胞相容性。结果上述方法使用的脱细胞溶液细胞毒性低；经该法处理后，血管的细胞成分完全去除，胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白等主要基质成分充分保留，组织结构完整，内皮细胞和平滑肌细胞可以在上面黏附生长，形成完整的细胞层。结论利用脱氧胆酸钠、SDS、EDTA和核酸酶联合消化的方法．可制备出基质成分充分保留、细胞相容性优良的脱细胞血管支架．适于构建组织工程血管。