首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到19条相似文献,搜索用时 93 毫秒
1.
邵清  成军  王琳  张健  卢成哲 《医学争鸣》2005,26(21):1942-1944
目的:为了研究NS3TP6可能的分子生物学功能,我们应用基因芯片技术,检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响. 方法:以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3TP6,以表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS3TP6后,有7条基因表达增强,38条基因表达降低. 结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因,为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.  相似文献   

2.
目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A)反式激活新型靶基因。方法:以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,通过序列同源性比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染peDNA3.1(-)-NS4A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果:该新基因的编码序列全长为963个核苷酸(nt),编码产物由321个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为NS4ATP1,在GenBank中注册,注册号为AY740521。结论:分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1,为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。  相似文献   

3.
目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B(HCV NS5B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法:以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交(SSH)分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200~1000 bp插入片段。测序及同源性分析,显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS5B反式激活靶基因。结论:成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。  相似文献   

4.
蔺淑梅  张树林  成军  刘敏  郭江  张黎颖  杨媛 《医学争鸣》2006,27(19):1741-1744
目的:筛选、克隆与乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)相互作用的蛋白基因C1的反式激活基因,探索该基因可能的生物学功能.方法:以分子生物学技术构建C1真核表达载体pcDNA3.1(-)-C1,以表达质粒pcDNA3.1(-)-C1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM—Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选阳性克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因C1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后挑选40个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200~1000bp插入片段,随机挑选含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得18种编码基因.结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞周期及代谢、肿瘤发生发展及肝脂肪变及肝纤维化发生发展密切相关的蛋白编码基因,推测了C1在体内可能存在的调控机制的线索.  相似文献   

5.
目的 研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别.方法 PCR扩增B、C基因型HBV X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC-XB及pcDNA3.1/HisC-XC).以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的X-press多肽表位抗体,通过Western blot检测目的 蛋白在不同时间段的表达.PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-Basic(重组载体为pGL-MDR).pGL-MDR分别与pcDNA3.1/His-GXB或pcDNA3.1/HisC-XC共转染HepG2细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性.实验数据以SPSS 11.5软件分析.结果 成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体.Western blot显示pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC在HepG2细胞中均能表达HBV X蛋白,以转染后48 h为最高.当pGL-MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2~1∶4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisC-XB pGL-MDR组>pcDNA3.1/HisC-XC pGL-MDR组>pcDNA3.1/HisC pGL-MDR组(对照组),且存在剂量-效应关系.结论 B、C基因型HBV X蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型.  相似文献   

6.
目的用酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒(HBV)前S1蛋白反式激活蛋白3(PS1TP3)的结合蛋白。方法通过聚合酶链反应扩增获得的PS1TP3基因,构建诱饵质粒pGBKT7-PS1TP3,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-Gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglII酶切后测序,进行生物信息学分析。结果筛选出30个与PS1TP3相互作用的蛋白,其中包括泛素蛋白酶E2、丝裂原活化蛋白激酶、β2-微球蛋白、磷酸酯酶张力蛋白等已知功能基因及4个未知功能序列,以及拼接新基因1个。结论成功克隆出PS1TP3蛋白的结合蛋白,为研究PS1TP3的分子生物学功能及HBV的致病机制提供了新的思路和线索。  相似文献   

7.
目的:筛选能被β干扰素反式调节的靶基因,研究β干扰素的生物学功能及其机制。方法:设计并合成β干扰素(IFNβ)特异性引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增IFNβ基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的IFNβ编码基因片段克隆到TA载体中,进行测序鉴定后构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-IFN-β。以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,转染HepG2细胞,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果:HepG2细胞经转染IFN-β之后,有70条差异基因表达,其中40条基因表达增强,30条基因表达降低。这些差异表达基因与细胞的增生、分化和细胞的信号转导密切相关。结论:应用基因表达谱芯片技术筛选到IFN-β的反式调节基因,为进一步探索IFN-β可能的调节机制及其生物学功能提供了新的依据。  相似文献   

8.
目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法:扩增HCV NS5A基因,构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3.1(-)—NS5A;并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达;与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果:质粒pcDNA3.1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白,共转染实验中pcDNA3.1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3.8倍。结论:构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白,并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因,深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。  相似文献   

9.
目的:探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法:以重组质粒pcDNA3-core(含有HCV核心蛋白编码基因)转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β-半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子/增强子功能的影响。结果:质粒pcDNA3-core在HepG2 细胞瞬时表达核心蛋白,共转染实验中pcDNA3-core组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的5.4倍。结论:HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子/增强子的特性,为进一步以差异显示逆转聚合酶链反应技术克隆相关基因提供实验基础。  相似文献   

10.
目的:应用基因芯片技术,对乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)聚合酶P结构域蛋白/逆转录酶(PR)的基因表达谱进行分析,探索PR对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法:设计并合成PR基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PR蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的PR编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-PR。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果:基因芯片技术所检测的1152个基因表达谱的筛选中,79条基因表达水平上调,90条基因表达水平下调。结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBVDNA聚合酶PR转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明PR蛋白可能的分子生物学机制提供依据。  相似文献   

11.
目的:构建乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒,借助GM—CSF的免疫佐剂作用,提高乙型肝炎DNA疫苗的免疫效果。方法:用PCR方法分别从pEcob6和pCD-hGM—CSF中扩增出基因S和GM-CSF,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建pcDNA3.1-S及融合表达质粒pcDNA3.1-GM-CSF-S,然后以重组质粒转染真核细胞,研究重组质粒体外表达。结果:经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒构建正确,细胞转染试验表明重组质粒能在COS-7及HepG-2内表达。结论:乙肝HBsAg和GM-CSF的融合表达质粒构建成功,重组质粒能在真核细胞内表达。  相似文献   

12.
目的:构建调控β-半乳糖苷酶(β-gal)基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法:根据2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因(TR)的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3~4 d后,给予强力霉素(4 mg•L-1),利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果:构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论:成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。  相似文献   

13.
食管癌相关基因2对EC9706细胞恶性增殖的抑制作用   总被引:5,自引:0,他引:5  
Li MN  Huang G  Guo LP  Lu SH 《中华医学杂志》2005,85(39):2785-2788
目的探讨食管癌相关基因2(esophageal cancer related gene2,ECRG2)对EC9706食管癌细胞恶性增殖的抑制作用及其机制。方法利用DNA重组技术,构建ECRG2真核表达质粒(pcDNA3.1ECRG2),在食管癌EC9706细胞中转染并表达ECRG2蛋白,观察细胞的生长状态,比较平板集落和软琼脂克隆形成能力的改变,分析ECRG2对EC9706恶性表型的影响。进一步采用WesternBlot检测p53、p21的改变。结果转染表达ECRG2后,EC9706细胞的生长受到干扰,细胞的增殖速度受到抑制,实验组细胞平板集落形成率为18%,而对照组为55%,两者间差异显著(P<0.05);肿瘤细胞的停泊非依赖能力降低,实验组软琼脂克隆体积小且形成个数(8±1.88)明显少于对照组(14.3±3.13),差异显著(P<0.05)。WesternBlot分析表明,EC9706细胞转染表达ECRG2后伴随着p53、p21蛋白表达上升。结论转染表达ECRG2蛋白能够部分逆转食管癌EC8706细胞的恶性表型,其过程可能与p53、p21通路密切相关。  相似文献   

14.
To study the effect of HBx gene on the apoptosis of the cell lines (L02, HepG2) and the interaction between HBx and X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), the apoptosis of pcDNA3.1-HBx transiently transfected cell lines (L02, HepG2) was detected by flow cytometry and the mRNA expression of XIAP was assayed by real-time RT-PCR. Our study showed (1) the mor- phology of L02/pcDNA3.1-HBx was changed and the appearance of the cells mimicked that of HepG2 cells; (2) HBx gene could be detected in L02/pcDNA3.1-HBx and HepG2/ pcDNA3.1-HBx; (3) the apoptosis rate of L02/pcDNA 3.1-HBx was higher than that of L02 cells (P<0.01) and the apoptosis rate of HepG2/pcDNA3.1-HBx was lower than that of HepG2 cells (P<0.05); (4) the XIAP expression in L02 was about 3 times that in L02/pcDNA3.1-HBx cells (P<0.01), and the expression of XIAP in HepG2/pcDNA3.1-HBx was about 4 times that in HepG2 (P<0.01). It is concluded that HBx gene may promote the apoptosis of normal hepatocytes and inhibit the apoptosis of cells of he- patic carcinoma by regulating the expression of XIAP.  相似文献   

15.
目的:构建人纤维介素(hfgl 2)基因的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。方法:提取人外周血单个核细胞的总RNA,逆转录得到cDNA,以其为模板,PCR扩增hfgl 2 cDNA片段,将目的片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3.1,将重组质粒转染CHO细胞并制作细胞爬片,对爬片进行免疫组化染色,显微镜下观察并摄片。结果:扩增出1.3kb的目的片段,并将其克隆至pcDNA3.1,经酶切鉴定和测序鉴定无误;重组质粒转染CHO细胞,细胞爬片免疫组化染色可见细胞质中存在明显的阳性棕染。结论:成功构建hfgl 2基因的真核表达载体,为进一步探讨其功能学和干预研究奠定了基础。  相似文献   

16.
突变型与野生型HPV16 DNA疫苗的免疫原性   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的评价突变人乳头瘤病毒16(HPV16)E7锌指结合区后HPV16E7 DNA疫苗的免疫原性.方法将构建的野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)DNA疫苗经肌肉免疫C57BL/6小鼠,分离脾单个核细胞,用E7特异性多肽刺激后,测定E7特异性白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的水平及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.同时以未加E7多肽组作对照组.结果经E7特异性多肽刺激后,pcDNA3.1/16ME7产生IL-2的斑点数明显高于pcDNA3.1/16E7、pcDNA3.1和空白对照组.pcDNA3.1/16ME7的斑点数是pcDNA3.1/16E7的5倍多,两组间差异有显著性(P<0.05);pcDNA3.1/16ME7产生的IFN-γ是pcDNA3.1/16E7的2倍,差异有显著性(P<0.05);LDH结果显示在E:T为45:1时,pcDNA16/E7、pcDNA16/ME7、pcDNA3.1及未经免疫的小鼠4组之间CTL细胞杀伤率分别为(28.7±1.2)%、(55±2.2)%、(12.5 2.0)%和(11.5±1.2)%,前两组与后两组中任一组之间差异均有显著性,前2组之间差异亦有显著性(P<0.05).而未加E7多肽组,各组间差异均无显著性(P>0.05).结论突变HPV16E7锌指结合区能显著增强DNA疫苗的免疫原性,是提高DNA疫苗免疫原性的策略之一.  相似文献   

17.
目的建立在体大鼠过表达cyp2j3基因模型,并观察过表达cyp2j3对心肌缺血-再灌注损伤的影响。方法采用心肌多点直接注射质粒的方法转染cyp2j3基因,实验分为3组:注射0.9%氯化钠注射液(NS组)、空载体质粒组(pcDNA3.1组)和重组质粒组(pcDNA3.1-2J3组),各组18只大鼠。在基因转染2周后各组取6只大鼠处死并取注射部位附近心肌采用RT-PCR、Westernblotting方法检测心肌组织CYP2J3 mRNA、蛋白的表达,其余采用结扎开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血-再灌注模型,用BL-420F生物信号采集处理系统记录血流动力学变化,用TTC染色的方法测定心肌梗死面积。结果基因转染2周后,转染pcDNA3.1-2J3组CYP2J3 mRNA及蛋白明显高于NS组及pcDNA3.1组,行心肌缺血-再灌注后转染pcDNA3.1-2J3组能够提高再灌注期左心室收缩末期压(left ventricular end-systolic pressure,LVESP)、左心室内压最大上升下降速率(±LVdp/dtmax),减少缺血期及再灌注期心肌梗死面积(P<0.05)。结论心肌直接注射质粒pcDNA3.1-2J3能够有效转染心肌组织并能够抗心肌缺血-再灌注损伤。  相似文献   

18.
目的 构建日本血吸虫组织蛋白酶B(Sjcb2)真核表达载体,检测日本血吸虫组织蛋白酶B2单独和联合吡喹酮(PZQ)在小鼠抗血吸虫再感染中的作用.方法 将60只BALB/c雌性小鼠随机均分为六组,建立日本血吸虫感染动物模型:感染组、感染攻击组、空质粒处理组、Sjcb2免疫组、吡喹酮处理组、Sjcb2联合吡喹酮处理组.Sjcb2免疫组和Sjcb2联合吡喹酮组分别在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接种pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒,空质粒处理组接种pcDNA3.1(+)空质粒.初次尾蚴感染后第六周,对吡喹酮处理组和Sjcb2联合吡喹酮处理组小鼠给予PZQ治疗.除感染组外其它各组在第八周再次进行尾蚴攻击感染.分别于第8周和第14周取各组小鼠肝脏组织做病理切片,观察虫卵肉芽肿大小;采用间接ELISA法检测血清中特异性IgE和IgG亚型(IgG1,IgG2和IgG3);检测各组小鼠荷成虫数,计算抗血吸虫再感染率.结果 Sjcb2免疫组、联合组与其它组分别比较,小鼠荷虫数显著性减少,抗血吸虫再感染率显著升高,虫卵肉芽肿直径显著减小,IgG1水平显著下降和IgE水平显著升高(P〈0.01).结论 Sjcb2在小鼠模型中具有抗日本血吸虫再感染作用,抗血吸虫再感染率为70.3%,抗再感染作用机制可能与特异性IgE水平升高和IgG1水平下降有关.  相似文献   

19.
目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1(+)与pcDNA3.1(+)/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1(+)相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E2;转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号